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Aug 07, 2023

共生渦鞭毛藻がサンゴ宿主に餌を与えることを可能にするトランスポーターの候補

Comunicazione ISME Volume 3,

ISME Communications volume 3、記事番号: 7 (2023) この記事を引用

2293 アクセス

24 オルトメトリック

メトリクスの詳細

サンゴと渦鞭毛藻の共生関係はサンゴ礁にとって極めて重要です。 サンゴは共生藻類に避難所、二酸化炭素、窒素を提供します。 その代わりに、共生藻類は動物宿主にグルコースの形で固定炭素を供給します。 しかし、共生藻類から動物宿主にどのようにグルコースが伝達されるかは不明である。 我々は、渦鞭毛藻の細胞膜に存在するトランスポーターが、周囲の宿主動物組織へのグルコースの外向きの移動を促進すると推論した。 我々は、刺胞動物の共生生物渦鞭毛藻Breviolum minutumにおいて、SWEETとして知られる促進性糖ユニポーターの遍在ファミリーに属する候補トランスポーターを同定した（糖は最終的に輸出トランスポーターとなる）。 これまでの遺伝子発現解析では、藻類が刺胞動物宿主内で共生している場合、自由生活状態と比較してBmSWEET1が上方制御されることが示されていた[1、2]。 免疫蛍光顕微鏡法を使用して、渦鞭毛藻細胞膜内の BmSWEET1 の局在を特定しました。 酵母代理輸送系における基質選択性アッセイにより、BmSWEET1 がグルコースを輸送することが示されました。 定量顕微鏡検査により、共生B. minutum細胞は同じ株の自由生活細胞よりも有意に多くのBmSWEET1タンパク質を持っていることが示され、これは共生中の輸出と一致するが、自由生活のプランクトン期には輸出されないことと一致している。 したがって、BmSWEET1 は適切な場所に適切なタイミングで存在し、共生する渦鞭毛藻類が動物宿主に餌を与えてサンゴ礁に電力を供給する輸送体となる適切な基質を持っています。

共生は、別々の種のスキルセットを組み合わせて、コンソーシアムとして環境選択の課題に対処する強力な進化戦略です。 サンゴ礁の場合、パートナーシップにより、そうでなければ生物量が非常に少なくなるであろう栄養の乏しい水域での豊かな成長が可能になります[3]。 サンゴ礁の共生は驚くほど成功しています。 サンゴ礁は海洋環境のわずか 0.1% しか占めていませんが、海洋多様性の 33% 以上を支えています [4]。

サンゴの共生藻類は、CO2と光エネルギーを使用して光合成により糖を製造します。 糖分はサンゴに与えられ、この共生的な「通貨移動」[5]が、ほとんどのサンゴが炭酸カルシウムを堆積してサンゴ礁を構築する能力を支えています[3]。 次に、サンゴの宿主は、その共生藻類に避難所、二酸化炭素、貴重な窒素を提供します。 共生生物から宿主への光合成によって固定された炭素の移動は、60 年以上前にマスカティーンとハンドによって実証されており [6]、共生生物はサンゴが使用するエネルギーの 90% ものエネルギーを供給しています [3]。 宿主から除去された共生生物を使用した初期の研究では、グリセロールが主な輸出物であることが示されていました[7]。 しかし、無傷のパートナーシップを使用した最近の研究では、グルコースが主要な輸出物であることが示されており、共生生物によるグリセロール放出は、共生生物を宿主から隔離することによって誘発される人工物であるか[8,9,10]、あるいはおそらくオスモライトとして共生ソームの液胞に輸送されるかのいずれかであることが示唆されている[8,9,10]。 11]。 したがって、どのような形態の光合成物が移動するのか、またどのくらいの量の移動が起こるのかはわかっていますが、移動がどのように起こるかについては本質的に何もわかっていません。

移動した光合成産物は少なくとも 2 つの膜を通過する必要があります。 そしていわゆるシンビオソームは、宿主による共生生物の貪食摂取中に生成される液胞様の膜である[12]。 グルコースが膜不透過性であることを考えると、おそらくグルコースを外側に移動させるトランスポーターが一方または両方の膜に存在するでしょう。 我々は、少なくとも 1 つのトランスポーターが共生生物の細胞膜に存在し、主に病院内で活性化すると仮説を立てています。 トランスポーターの同定に向けて、我々は以前、サンゴとイソギンチャクの渦鞭毛藻共生生物である Breviolum minutum [1] の自由生活細胞と共生細胞における遺伝子発現を比較しました [13]。 いくつかのトランスポーターは病院で発現の亢進を示し[1]、そのうちの 1 つ (BmSWEET1 と呼ぶ) はここでさらに特徴付けられています。

遺伝子型 AIMS3 [13] の Exaiptasia diaphana イソギンチャクは、26 °C の一定温度、12:12 時間の明暗の光周期、および 15 μmol 光子 m-2 s-1 ( GBR イソギンチャクは光に敏感で、常に空気が供給される低光条件を好みます [13])。 イソギンチャクは、海水（紅海塩、塩分濃度 34 ppt）を入れた 3 つの複製 2.4 L プラスチック容器内で同じ条件下で維持されました。 イソギンチャクには、週に 2 回、孵化したばかりの Artemia sp. を自由に与えました。 ノープリウス (一定の空気供給下で一晩孵化) と糸状藻類は、毎週完全に水を交換する前に除去されました。

B. minutum 細胞は、遺伝子型が特定された単一の E. diaphana アネモネから単離および培養されました [14]。 ３つの複製継代培養物を、１×ディアゴＩＭＫ培地（Novachem）を補充した０．２μｍ濾過海水（ＦＳＷ）を含む細胞培養フラスコ（０．２μｍ膜通気キャップ）内で生成した。 培養物は、26℃の一定温度、12:12時間の明暗の光周期、および60μmol m-2 s-1の光子の下で、増殖チャンバー(740FHC LED、HiPoint)内に維持された。 培養物は光学顕微鏡によって定期的に監視され、その健康状態（細胞は無傷で、生命力があり、運動性の細胞が存在する）を評価した。 複製継代培養物は、タンパク質の抽出および免疫蛍光のためのサンプリングの前に、少なくとも6か月間保管および維持されました。

BmSWEET1 のアミノ酸配列は、B. minutum トランスクリプトーム (GICE01031994) から推定されました [1]。 分子量は、ExPASy Compute PI/MW ツール (https://web.expasy.org/compute_pi/) を使用して計算されました。 推定上の膜貫通ドメインは、Phobius [15] および HMMTOP [16] プログラムを使用して予測されました。 BmSWEET1 の予測構造は ColabFold [17] を使用して生成され、ChimeraX [19] を使用してイネの OsSWEET2b の解析済み構造 [18] と重ねられました。

BmSWEET1 に対する抗血清は、合成抗原ペプチド (Mimotopes) と Walter and Eliza Hall (WEHI) Antibody Facility (Bundora, VIC) のサービスを利用して生成されました。 抗 BmSWEET1 は、キーホールリンペットヘモシアニンと結合したペプチド RKKPDENSPVSPS に対して作成され、合計 4 回の追加免疫を含む 82 日間の免疫および採血スケジュールで 2 匹の異なるウサギを免疫するために使用されました。 ウサギ血清からの IgG をアフィニティーカラム (WEHI) を使用して精製し、抗原に対する免疫反応性 (効率および特異性) を ELISA (WEHI) およびウェスタンブロッティング (以下を参照) によって評価しました。

タンパク質は、以下の修正を加えて [20] に記載されているように B. minutum 培養物から抽出されました。 20 mlの培養物からの細胞を15,000 rpmで1分間遠心分離してペレット化し、その後FSWで洗浄した。 ２回目の遠心分離に続いて、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）を含むＦＳＷで再懸濁した。 このステップを２回繰り返した。 ペレットを、プロテアーゼ阻害剤（Roche完全EDTAフリーPIカクテル）を補充した抽出緩衝液（100mM Tris、10mM EDTA、100mM NaCl、pH 7.4）でさらに再懸濁した。 710 ～ 1180 mm の酸洗浄ガラスビーズ (Sigma) および TissueLyser II (Qiagen) を使用して、30 Hz で 90 秒間、細胞を均質化しました。 ビーズを除去し、ホモジネートを 15,000 rpm、4 °C で 5 分間遠心分離しました。 上清を保存し、製造元の指示に従って Qubit タンパク質アッセイキット (ThermoFisher) を使用してタンパク質濃度を測定しました。

20 ～ 30 μg のタンパク質サンプルを、総量 40 ～ 50 μl のボルト LDS サンプルバッファー (ThermoFisher) およびボルトサンプル還元剤 (ThermoFisher) とともに煮沸 (70 °C、10 分間) しました。 タンパク質は、Bolt 4–12% Bis-Tris Plus Gel (ThermoFisher) で分離され、製造元の指示に従ってニトロセルロース膜に転写されました。 膜を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＴＢＳ）を含有するＴＢＳ緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、２４．８ｍＭ トリス塩基、ｐＨ７．４）中の５％スキムミルクで一晩ブロックした。 メンブレンを一次抗体で 1 時間ブロットし、TTBS で 5 分間 3 回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼに結合した Amersham ECL 抗ウサギ IgG (Bio-Strategy) とインキュベートしました。 さらに 5 分間の洗浄を 3 回行った後、膜を SuperSignal West Pico PLUS 試薬 (ThermoScientific) に 5 分間曝露しました。

抗血清の特異性を検証するために、上記のようなウェスタンブロッティングの前に、室温で振盪しながら血清をペプチド抗原（1:1 モル比）と1時間プレインキュベートしました。

培養された自由生活細胞と共生細胞 (イソギンチャクから単離されたばかり [1]) の 3 つの複製 B. minutum 細胞を、抗 BmSWEET1、免疫前血清、または一次抗体なしのいずれかで免疫蛍光標識し、その後洗浄し、二次蛍光標識しました。抗体は以下の通り。

定量的免疫蛍光のために、3 つの複製フラスコのそれぞれから 2 ml (約 1 × 106 細胞) がサンプリングされました [16]。 細胞を１５，０００ｒｐｍで１分間回転させることによってペレット化し、２ｍｌのＦＳＷで洗浄した。 細胞を、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液（PBS）（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4）中の4%パラホルムアルデヒド（Electron Microscopy Sciences）とともに4℃で3時間インキュベートすることによって固定しました。 透過処理のために、細胞を PBS 中の 0.1% Triton X100 とともに 10 分間インキュベートしました。 細胞をペレット化し、ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で３回洗浄した。 次に、非特異的結合のブロックは、PBST 中の 1% ウシ血清アルブミン (BSA) (Sigma) とともに 2 時間インキュベートすることによって達成されました。 さらに、細胞のペレットを、PBST中の0.1% BSAで希釈した一次抗体で懸濁し、4℃で一晩インキュベートしました。 ＰＢＳＴで３回洗浄した後、細胞を暗所で２時間、ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ＰＢＳＴ中０．１％ＢＳＡ中１：５００で懸濁した。 最後に、細胞を、ＰＢＳＴ中０．１％ＢＳＡ中のＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１：１００とともに暗所で１０分間インキュベートした。

遺伝子型 AIMS3 の中型イソギンチャク 20 ～ 30 匹から、ガラスホモジナイザーで均質化し、15,000 rpm で 1 分間複数回 (約 10 回) スピンし、FSW で洗浄することにより、共生細胞を単離しました。 この手順により、得られたホモジネート中の宿主細胞が最小限に抑えられました。 IFAプロトコルの残りの部分は、培養共生生物について上記で説明したものと同じでした。

サンプル 5 μl を、ProLong™ Glass Antifade Mountant (ThermoScientific) を使用して PTFE プリント スライド (SPI 供給品) にロードし、倒立共焦点 Nikon A1R 顕微鏡で可視化しました。 画像は、DAPI および TRITC フィルターを使用して取得されました。

シグナル強度の定量化は、Fiji ソフトウェア (ImageJ) [21] を介して画像をさらに分析することによって達成され、これにより、タンパク質量の代用として BmSWEET1 シグナルを比較することができました。 3 つの複製と各処理のそれぞれからランダムに選択された細胞 (少なくとも 100 個の細胞) が、その形状、サイズ、およびクロロフィルの自己蛍光に基づいて識別されました。 次に、二次抗体からの蛍光に基づいて、細胞周囲の染色の平均強度を決定しました。 自由生活藻細胞と共生藻細胞の細胞壁の厚さに有意な差は観察されなかったので（図S1）、標識試薬へのアクセスは同等であると仮定します。

定量的顕微鏡検査のための統計分析は、SPSS ソフトウェア (バージョン 20.0.、IBM Corp) を使用して実行されました。 データの正規性と等分散性がテストされました。 統計的に有意な結果を区別するために、二元配置分散分析とその後の事後 (Tukey HSD) 多重比較検定を使用しました (p < 0.05)。

免疫蛍光の 3 つのネガティブ コントロールを実行しました。 1 つ目は免疫前血清による標識でしたが、シグナルは得られませんでした (図示せず)。 2 つ目は、血清をスライドに添加する前に、室温で振盪しながら血清をペプチド抗原 (1:1 モル比) と 1 時間プレインキュベートした結果、黄色の BmSWEET1 シグナルは発生しませんでした (図示せず)。 3 番目のネガティブ コントロールは、一次抗体を省略したものです。

AtSWEET1 (AT1G21460) および AtSWEET11 (AT3G48740) のコード配列は、それぞれプライマー SF46/SF47 および SF52/SF53 (表 S1) を使用してシロイヌナズナ cDNA から増幅されました。 BmSWEET1 の cDNA 配列は、Saccharomyces cerevisiae 用にコドン最適化され、Integrated DNA Technologies によって合成されました。 合成した遺伝子断片をプライマーSF50/SF51を用いたPCRに使用した。 PCR フラグメントを pJet1.2 (Thermo Fisher Scientific) にサブクローニングし、配列決定によって検証しました。 PacI および XhoI で消化した後、断片を酵母発現ベクター pDR195 に連結しました [22]。

複数のヘキソースインポーター [23] の変異体である酵母 EBY4000 株 [hxt1–17D::loxP gal2D::loxP stl1D::loxP agt1D::loxP ydl247wD::loxP yjr160cD::loxP] を、異なる pDR195 ベクターで形質転換しました。 –[24]に記載されているように、それぞれインサートとして AtSWEET1、AtSWEET11、BmSWEET1、またはインサートなしの pDR195 ベクターのいずれかを含みます。 形質転換体をYNB培地+\({{{\mathrm{NH}}}}_{4^{+}}\)、+His、+Trp、+2%Mal、-Uraで選択し、PCRによって確認した。

グルコース取り込み活性をテストするために、さまざまな酵母株を YNB 培地 (+ His、+ Trp、+2% Mal) 中で 30 °C、160 rpm で一晩前培養しました。 EBY4000では培地に浦を添加しました。 細胞を遠心分離（2500×g、10分間、室温）によって回収し、TE緩衝液（10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA）で2回洗浄した。 光学密度をOD600 = 3に調整しました。酵母株を、Uraを含むまたは含まず、炭素源として2% MalまたはGlcのいずれかを補充したYNB培地プレート上に段階希釈としてスポットしました。 さらに、0.2% 2-デオキシ-D-グルコースの効果もテストされました。 炭素源としてFruを使用して30℃で3日間インキュベートした後、または30℃で5日間インキュベートした後、増殖を写真によって記録した。

BmSWEET1 (GICE01031994) は、SWEET (糖は最終的に輸出されるトランスポーター) として知られるトランスポーターファミリーのメンバーと高い配列類似性を持っています (図 1A)。 SWEETは最初に植物で発見された[25]。その役割には、非光合成根に輸送するために葉から糖を輸出すること、新しい植物に生命のスタートを与えるために種子に糖をロードすること、そして誘引するために花の蜜腺に糖を分泌することが含まれる。花粉媒介者[25、26]。 SWEET は植物で最初に発見されて以来、動物 [27]、菌類 [28]、原生生物 [28、29]、細菌 [28、29]でも確認されています。 真核生物のSWEETは、明らかに半SWEETとして知られる2つの原核生物のハーフトランスポーターの融合によって生じた[28]。 2つの三重らせんバンドルが反転リンカーらせん（つまり、7つの膜貫通ドメイン）を介して接続された真核生物のSWEETの構造は、2つの半SWEET遺伝子の融合と一致しています[18、28]。 SWEET は、濃度勾配の下での糖の拡散を促進する双方向ユニポーターです [25、30]。 植物では、基質はグルコース、フルクトース、およびスクロースである可能性があります[25、30]。

高レベルの配列類似性を示す BmSWEET1 と OsSWEET2b (イネ SWEET2b) のアライメント (* [アスタリスク] は完全に保存された残基を持つ位置を示します。: [コロン] は、強く類似した特性のグループ間の保存を示します。[ピリオド] はグループ間の保存を示します)弱く類似した特性の[19])。 BmSWEET1 の 2 つの MtN3 ドメインはピンクのバーで示されています。 BmSWEET1 の予測される膜貫通ヘリックスは灰色のテキストで示されます。 OsSWEET2b (17) の顔面外ゲートにあるチロシン 61 (緑色) は、OsSWEET2b 基質トンネル (17) を裏打ちする 4 つのプロリンのうち 3 つ (赤色) と同様に、BmSWEET1 にも保存されています。 OsSWEET2b (17) の基質選択部位のアスパラギン ペア (小文字の n) は、このアライメントからは BmSWEET1 では明らかではありません。 抗 BmSWEET1 血清の生成に使用されたペプチドは赤い線で示されています。 B 7 つの膜貫通ヘリックスを示すイネ OsSWEET2b の解明された構造 [18]。 C ColabFold は、8 つの膜貫通ドメインを示す BmSWEET1 の構造を予測しました。 BmSWEET1 抗血清の生成に使用されたペプチドのおおよその位置は赤い線で示されています。 D OsSWEET2b (ベージュ) と BmSWEET1 (青色) 構造の重ね合わせ。広範な共直線性と BmSWEET1 の追加の N 末端膜貫通ドメイン (右側) を示​​します。

BmSWEET1 は、典型的な真核生物 SWEET の一次構造の特徴、すなわち 2 つの MtN3/唾液ドメインと 7 つの予測される膜貫通ヘリックスを持っています [18、25]。 8番目の膜貫通ドメインの可能性は、植物SWEETと共有されないBmSWEET1のN末端伸長部にあると予測されている（図1A）。 BmSWEET1 とイネ SWEET2b (OzSWEET2b) のアラインメント [31] は、高レベルの配列同一性を示し (図 1A)、外部ゲートのチロシン [18、25]、および配列する 4 つのプロリンのうち 3 つなどの保存された特徴を示します。輸送経路 [18、25] は BmSWEET1 で明らかです (図 1A)。 しかし、OsSWEET2b [18] のグルコース基質認識部位を囲む一対のアスパラギン残基は、BmSWEET1 では明らかではありません (図 1A)。 Alpha Fold [17] を使用して BmSWEET1 の構造を予測し (図 1C)、予測された渦鞭毛藻タンパク質の構造をイネの解明された構造である OsSWEET2b [18] (図 1B) と比較しました。 AlphaFold は、BmSWEET1 に 8 つの膜貫通ドメインが存在することを裏付けました (図 1C)。 予測された BmSWEET1 構造は OsSWEET2b 構造 [18] に非常に似ており、7 つの膜貫通ヘリックスがほぼ正確に重なっています (図 1D)。 BmSWEET1 タンパク質で予測される追加 (8 番目) の膜貫通は、この図では右側にあり (図 1C)、N 末端が内部にあることになります。これは、N 末端が細胞外にある米タンパク質とは対照的です。 18]。 BmSWEET1 において余分な (8 回目の) 膜貫通がどのような役割を果たしているのか、また BmSWEET1 がイネのグルコース促進トランスポーターと同様にホモ三量体として存在するのかどうか [18] は、まだ解明されていない。 それにもかかわらず、渦鞭毛藻と植物が最後に共通の祖先を共有したのが約 20 億年前であることを考えると、2 つのタンパク質の類似性 (図 1D) は注目に値します [32]。 配列分析と構造モデリングに基づいて、我々は、BmSWEET1 が不定の基質優先性を持つ双方向性糖ユニポーターである可能性が非常に高いと考えています。

5 つの追加の SWEET 様遺伝子も、B. minutum ゲノム リソース [2] (表 S1) で明らかです。 それらはどれもホスピタでは上方制御されなかった[1]ので、ここではさらに特徴付けません。 重要なことに、ゲノムリソースが利用可能な他の共生渦鞭毛藻にもSWEET様遺伝子が見つかったことです（表S1）。

BmSWEET1 は WoLF PSORT によって細胞膜タンパク質であると予測されており [33]、我々の次のステップはタンパク質の局在を特定することでした。 BmSWEET1 に特有のペプチド (RKKPDENSPVS) に対する抗血清 (図 1A、C) は、SDS-PAGE で分離された B. minutum タンパク質のウェスタンブロットにおいて、見かけの質量 54 kDa の単一バンドを修飾します (図 2A)。 血清をペプチドとプレインキュベートすると、このバンドへの血清の結合が消失し(図2B)、血清がBmSWEET1ペプチドに対して特異的であることが実証された。 BmSWEET1 の見かけの質量は、膜タンパク質が SDS-PAGE で異常に移動することが多いことを考慮すると、予測質量 (35 kDa) と合理的に一致しています [34]。

A ペプチド抗血清は、培養細胞内の分子量 56 kDa の単一バンドを標識します。 B 標識は、血清を抗原ペプチドとプレインキュベートすることによって無効になります。 C DAPI で青色に標識された 10 個の B. minutum 培養細胞。 D 黄色の BmSWEET1 抗血清。 E 赤色のクロロフィル自家蛍光。 F 明視野照明。 G すべてをマージし、BmSWEET1 が細胞の周囲にあり、核や色素体と結合していないことを示します。 H カルコフルオルでセルロースを染色した単一培養 B. minutum 細胞のマゼンタの拡大図。 I H と同じ細胞は BmSWEET1 を黄色で標識、J H と同じ細胞はクロロフィルの自己蛍光を赤色で示します。 K 明視野照明における H と同じセル。 L カルコフルオールと BmSWEET1 の結合。BmSWEET1 タンパク質の大部分がセルロース壁の内側にあることを示しています。 M 細胞壁の直下に位置する細胞膜を示す B. minutum 細胞の電子顕微鏡写真。

この血清を用いた免疫蛍光アッセイにより、BmSWEET1 は渦鞭毛藻細胞の周縁部に位置し、青色の DAPI 染色された核とは結合していないことが示されました (図 2C)。 BmSWEET1は、色素体を定義する赤色クロロフィル自家蛍光の遠位にあり、おそらく葉緑体膜タンパク質ではありません（図2E-J）。 セルロースマゼンタの染色に使用したカルコフルオールホワイトとの同時染色により、BmSWEET1タンパク質が細胞壁の外層またはその直下、おそらく渦鞭毛藻の細胞膜に存在することが明らかになりました（図2H–M）。 我々は、BmSWEET1 は主に B. minutum の細胞膜 (原形質膜) タンパク質であると結論付けています。

BmSWEET1 が実際に糖トランスポーターであるかどうか、またその好ましい基質が何であるかを決定するために、我々は広く使用されている酵母変異体相補アッセイを適用しました [18、25、26、28]。 酵母ヘキソーストランスポーター変異体 EBY4000 はグルコースを取り込むことができず、グルコース寒天上で増殖できません [23]。 EBY4000は発現プラスミドpDR195で形質転換することができ、これによりグルコースインポーターを発現する場合にグルコース培地上で増殖する能力が付与されます。 SWEET は糖を高濃度から低濃度に輸送できる双方向の促進因子であるため、機能的な SWEET を発現する酵母は培地から選択された糖を取り込むことができます [18]。

BmSWEET1、シロイヌナズナ SWEET1 (グルコース トランスポーター [25])、AtSWEET11 (シロイヌナズナ スクロース トランスポーター [26])、および空の pDR195 ベクター (トランスポーター遺伝子を含まない) を発現する形質転換体を、炭素として 2% マルトースを含む固体 SD 培地上で選択しました。ソースを 30 °C で 4 日間培養した後、マルトースまたはグルコース プレートのいずれかに一連の希釈としてスポットしました。どちらも pDR195 含有株を選択するためにウラシルを除いたものです (pDR195 はオロチジン-5'-リン酸デカルボキシラーゼ [URA3] も発現します。ウラシル生合成に必要です）。

全ての株はウラシルを補充したマルトースプレート上で増殖した（図３Ａ）。 非形質転換EBY4000は、ウラシルを欠くマルトースプレート上では増殖しなかった(図3B)。 予想通り、空のベクター酵母 (pDR195) はマルトース プレート上で増殖できましたが (図 3A、B)、グルコース プレート上では増殖できませんでした (図 3C)。 同様に、AtSWEET11 発現酵母はマルトース プレート上で増殖しましたが (図 3A、B)、グルコース プレート上では増殖しませんでした (図 3C)。これは AtSWEET11 がスクロース トランスポーターであることと一致しています [26]。 逆に、既知のグルコーストランスポーター AtSWEET1 [25] を発現する酵母はグルコースで増殖しました (図 3C)。 BmSWEET1を発現する酵母もグルコース上で増殖し(図3C)、BmSWEET1がグルコーストランスポーターであることが確認された。

A 未形質転換酵母株 EBY4000 と、シロイヌナズナ グルコース トランスポーター AtSWEET1、シロイヌナズナ スクロース トランスポーター AtSWEET11、または B. minutum 推定トランスポーター BmSWEET1、または空のベクターを保有する発現プラスミド pDR195 で形質転換された株はすべて、ウラシルを補充したマルトース (Mal) プレート上で増殖します (浦）。 B マルトースプレートからウラシルを省略した場合、非形質転換変異体 (EBY4000) はウラシルに対して栄養要求性であるため、増殖できません。 C マルトースがグルコース (Glc) に置き換えられた場合、グルコース インポーターを発現する酵母、すなわち AtSWEET1 形質転換体および BmSWEET1 形質転換体のみが生き残ることができます。 D 逆に、マルトース基質に有毒なグルコース類似体 (2-デキソイ-D-グルコース) が補充されると、ヘキソースインポート能力のある株 (つまり、AtSWEET1 形質転換体および BmSWEET1 形質転換体) は死滅しますが、ヘキソースインポート能力のない株 (AtSWEET11 および pDR195 が空) は死滅します。ベクター）はマルトースを使用して増殖でき、2-デキシ-D-グルコースによる毒を受けません。 E フルクトース (Fru) が炭素源として供給されると、AtSWEET1 形質転換体 (フルクトースを取り込むことができる) が増殖し、程度は低いですが BmSWEET1 形質転換体も増殖します。 希釈系列プレート全体の画像を図 S1 に示します。

BmSWEET1 によるグルコース輸送のさらなるテストとして、有毒なグルコース類似体である 2-デオキシ-D-グルコースを使用しました (図 3D)。 マルトースと 2-デオキシ-D-グルコース上にプレーティングされた酵母形質転換体は、グルコース移入能がある場合には死滅します。 したがって、AtSWEET1 または BmSWEET1 を発現する酵母はこのアッセイでは増殖しませんでしたが、AtSWEET11 を発現する酵母、またはトランスポーターを発現しない (空のベクター) 酵母は有毒なグルコース類似体を取り込むことができなかったため、正常に増殖しました (図 3D)。

また、BmSWEET1 のフルクトース輸送能力もテストしました (図 3E)。 AtSWEET1を発現する酵母は予想どおりフルクトース上で増殖し[35]、BmSWEET1を発現する酵母による制限された増殖もフルクトース上で明らかであり(図3E)、これはBmSWEET1のフルクトース輸送能力がある程度あることを示している。 我々は、BmSWEET1 トランスポーターの最適な基質はグルコースであると結論付けています。

次に、我々は、抗血清を使用してタンパク質レベルを測定することにより、藻類が動物宿主内で共生している場合にBmSWEET1がより豊富であるというトランスクリプトームの証拠を裏付けることを試みました[1、2]。 他の SWEET と同様に、BmSWEET1 は明らかに受動的拡散の無制御の促進因子であるため、自由生活のプランクトン状態でグルコース排出因子を発現させることは不適応であるように見えます。 自由生活細胞は貴重なグルコースを海洋に輸出する可能性は低く、グルコースが環境に漏洩すると、藻食性の捕食者を引き寄せる可能性もあります[36]。 逆に、共生細胞は、共生「通貨交換」の役割を果たすために、より多くの BmSWEET1 を発現すると予想されます [5]。

ウェスタンブロッティングを使用して、自由生活藻類と共生藻類の両方におけるBmSWEET1の量を測定しようとしましたが、ローディングコントロールとして使用するための他の構成的に発現された渦鞭毛藻タンパク質に対する抗体が不足しており、単離された共生生物のブロットではバックグラウンドレベルが高かったため（明らかに原因）アネモネの汚染による）により、このアプローチは不要になりました。 したがって、我々は、個々の細胞（自由生活 B. minutum 細胞、またはイソギンチャクの宿主 E. diaphana から新たに単離された同じ株の共生細胞）における BmSWEET1 の免疫蛍光標識を定量することにしました（図 4）。

インビトロで培養されたAC Breviolum minutum細胞。 D – F 宿主イソギンチャクから新たに単離された同じ株の細胞。 両方の細胞セットを BmSWEET1 タンパク質について免疫染色し、並行して画像化して標識強度を比較しました。 比較的弱い BmSWEET1 標識を示す自由生活細胞における BmSWEET1 標識は黄色で示されています。 B 明視野照明。 C すべてをマージします。 宿主イソギンチャクに共生する B. minutum 細胞は、強力な BmSWEET1 標識を示します。 E 明視野照明。 F すべてをマージします。 G-J 2 つの集団（自由生活対入院施設）の免疫染色を 3 回実行し、100 個を超える細胞 (n) について標識強度を測定し、箱ひげ図として表しました。 G 自由生活細胞の蛍光強度。 H 病院内の細胞の蛍光強度。 I、J バックグラウンド蛍光強度は、一次抗血清を使用しない以外は同様に調製した同等の数の細胞で定量化し、一次抗体で標識した自由生活細胞で測定した値よりもわずかに低かった（Gと比較）。

2 つの藻類サンプルの抗体標識とイメージングは​​、同じ条件と顕微鏡設定で並行して行われました (図 4A ～ F)。 標識と定量的比較は 3 回に分けて行われ、各処理で 100 個を超える細胞の蛍光強度が定量化されました (図 4G-J)。 ベースライン/バックグラウンド標識は、一次 BmSWEET1 抗血清を省略することによって確立されました (図 4I、J)。 定量により、この藻類は、自由生活時（図４Ｇ）よりも、ホスピタ内で有意に多くのＢｍＳＷＥＥＴ１タンパク質を有することが示される（図４Ｈ）。 自由生活細胞と新たに単離された共生細胞に対する抗体の異なるアクセス可能性を制御するために、細胞壁の厚さを測定しました。これは、壁の厚さの中央値が2つのグループで変わらないことを示しました（図S2）。 共生する渦鞭毛藻は、自由に生きている in vitro 培養された対応物（60 μmol m-2 s-1 光子、材料と方法を参照）よりも低い光強度（15 μmol m-2 s-1 光子）で存在します。 光強度がBmSWEET1タンパク質の量に影響を及ぼさないことを制御するために、我々は2つの培養物に対して免疫蛍光を行った。1つは60μmol m-2 s-1光子で増殖させ、もう1つは15μmol m-2 s-1光子で増殖させた。 in vitro での異なる光強度において、BmSWEET1 免疫蛍光標識に有意差は観察されませんでした (図 S3)。

興味深いことに、自由生活状態での標識レベル (図 4G) は、一次抗血清を省略したネガティブ コントロール (図 4I、J) をわずかに上回っています。これは、この期間中の BmSWEET1 発現が最小限であるという我々の仮説と一致しています。無駄なグルコースの輸出や藻食動物を引き付ける危険性を最小限に抑えるための生命期[36]。 宿主分泌因子は、渦鞭毛藻の共生生物からの固定炭素の輸出を誘導すると考えられており [37,38,39]、さまざまな植物病原体は植物の SWEET を上方制御して宿主の糖へのアクセスを獲得することができる [40]。病院での BmSWEET1 の発現亢進を引き起こします。

我々は、共生藻類ではBmSWEET1が上方制御されており、おそらくより安定していると結論付けており、これはBmSWEET1が宿主に栄養を与えることができるグルコースの輸出者であることと一致している。

私たちは、自由生活と比較してホスピタ内で遺伝子発現レベルが上方制御されていることが以前に示されていた、共生渦鞭毛藻B. minutumの推定グルコーストランスポーターBmSWEET1に焦点を当てました[1]。 配列分析と構造モデリングにより、BmSWEET1 が糖の濃度勾配下への拡散を助ける促進的な糖輸送体であることが示唆されました。 私たちはBmSWEET1が共生生物の細胞膜に局在していることを突き止めました。 われわれは、BmSWEET1がヘキソース輸送欠損酵母変異体を補うことによってグルコースを輸送することを示した。 最後に、我々は定量的顕微鏡法により、イソギンチャク宿主内に生息する B. minutum 渦鞭毛藻が、同じ株の自由生活細胞よりも細胞膜に実質的に多くの BmSWEET1 を保有していることを示しました。

したがって、BmSWEET1 は、渦鞭毛藻と無脊椎動物の共生におけるグルコースの共生輸送体の候補となる 3 つの特性を備えています: i/ 適切な位置 (藻類細胞膜)、ii/ 適切な基質 (グルコース)、および iii/ 病院での顕著に高い発現レベル。 グルコース源として渦鞭毛藻の光合成を、グルコースシンクとして宿主動物の呼吸を行うBmSWEET1は、内部共生生物から宿主へのグルコースの拡散を促進し、サンゴに栄養を与えてサンゴ礁の形成を支える理想的なゲートウェイです。

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この研究は、オーストラリア研究評議会ディスカバリー助成金（GIM および MvO への DP160101539、GIM への DP210100639、MJHvO への DP180102630）およびオーストラリア研究評議会受賞者フェローシップ（GIM への FL170100008、および MJHvO への FL180100036）によって支援されました。 APMW と ME は、CRC1535「MiBiNet」を通じたドイツ研究財団の支援に感謝しています。 EBY4000 株を提供していただいた Eckhard Boles に感謝します。

クールなマア・ランドー

現在の住所：イスラエル、ハイファ、ハイファ大学、レオン・H・チャーニー海洋科学大学院海洋生物学部

マリオン・アイゼンハット

現在の住所: ビーレフェルト大学、CeBiTec、生物学部計算生物学、ビーレフェルト、ドイツ

ジェイド・トルトレッリ

現在の住所: 米国ハワイ州カネオヘ、ハワイ海洋生物学研究所、サンゴ回復力研究所

メルボルン大学生物科学部、パークビル、ビクトリア州、オーストラリア

ケレン・マオール＝ランドー、ジャーダ・トルトレッリ、アリソン・ファン・デ・メーン、マデリン・J・H・ヴァン・オッペン、ジェフリー・I・マクファーデン

植物生化学研究所、植物科学クラスター (CEPLAS)、ハインリッヒ ハイネ大学、Universitätsstraße 1、D-40225、デュッセルドルフ、ドイツ

マリオン・アイゼンハット、サマンサ・クルツ、アンドレアス PM ウェーバー

生物光学顕微鏡プラットフォーム、メルボルン大学、パークビル、ビクトリア州、オーストラリア

ガブリエラ・シーガル

オーストラリア海洋科学研究所、タウンズビル、クイーンズランド州、オーストラリア

マデリン・J・H・ヴァン・オッペン

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KM-L、ME、MJHvO、APMW、および GIM は、原稿の概念開発と最終編集版に貢献しました。 KM-L、ME、GT、AvdM、SK、GS が実験を実施しました。 KM-L、ME、MJHvO、APMW、GIM が原稿を執筆しました。

ジェフリー・I・マクファーデンへの通信。

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転載と許可

Maor-Landaw、K.、Eisenhut、M.、Tortorelli、G. 他共生渦鞭毛藻がサンゴ宿主に餌を与えることを可能にするトランスポーターの候補。 共通のイズム。 3、7 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s43705-023-00218-8

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受信日: 2022 年 11 月 2 日

改訂日: 2023 年 1 月 10 日

受理日: 2023 年 1 月 18 日

公開日: 2023 年 1 月 28 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00218-8

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