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Jan 04, 2024

代償性エピスタシスは SARS における ACE2 親和性を維持する

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 7011 (2022) この記事を引用

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29 オルトメトリック

メトリクスの詳細

Omicron BA.1 の亜種は 2021 年後半に出現し、すぐに世界中に広がりました。 初期の SARS-CoV-2 変異体と比較して、BA.1 には多くの変異があり、その一部は抗体の回避を可能にすることが知られています。 これらの抗体エスケープ変異の多くは、個別に ACE2 に対するスパイク受容体結合ドメイン (RBD) の親和性を低下させますが、BA.1 は依然として高い親和性で ACE2 に結合します。 したがって、BA.1 系統の適合性と進化は、多数の突然変異の複合効果によって推進されます。 ここでは、武漢 Hu-1 株と比較して、BA.1 の RBD における 15 個の変異間のエピスタティック相互作用を体系的にマッピングします。 具体的には、祖先の武漢 Hu-1 株から BA.1 までの考えられるすべての進化中間体にわたる、これら 15 個の変異 (215 = 32,768 遺伝子型) の考えられるすべての組み合わせの ACE2 親和性を測定します。 BA.1の免疫回避変異は個別にACE2親和性を低下させるが、Q498RやN501Yなどの他の親和性を高める変異とのエピスタティック相互作用によって補われることを我々は発見した。 したがって、ACE2 親和性を維持しながら免疫を回避する BA.1 の能力は、複数の相互作用する変異の獲得に依存します。 私たちの結果は、代償性エピスタシスがSARS-CoV-2の実質的な進化的変化を引き起こす重要な要因であることを示唆しており、慢性感染から生じるOmicron BA.1と一致しています。

SARS-CoV-2 のオミクロン BA.1 変異体は 2021 年 11 月に出現し、ワクチン接種を受けた人や以前に感染した人が持つ既存の免疫から逃れる能力によって部分的に推進され、世界中に急速に広がりました 1,2。 驚くべきことに、オミクロンは当時広く普及していたデルタ系統の子孫として現れたわけではありません。 その代わり、スパイクタンパク質受容体結合ドメイン (RBD) 内の 15 の変異を含む、当時広く流通していなかった系統内に数十の変異を蓄積した後、高度に分岐した株として出現しました1。

最近の研究では、これら 15 個の RBD 変異の多く (その一部は他の変異体にも見られる) が特定のモノクローナル抗体 3、4、5、6、7 の結合を妨害し、免疫逃避に寄与する可能性があることが示されています。 しかし、これらの変異のほとんどは、武漢 Hu-1、デルタ、または他のいくつかの SARS-CoV-2 系統内で発生した場合、ヒト ACE2 への結合親和性を低下させることも示されており 8,9 、ウイルスの宿主細胞への侵入を損なう可能性があります。 対照的に、Omicron RBD は、ACE210,11 に対する強い親和性を維持しながら、これらの回避変異を許容します。このことは、この系統の他の変異がウイルス侵入の維持に役立つ可能性があることを示唆しています。

これまでの研究では、例えば深部突然変異スキャン (DMS) を使用することにより、抗体結合と ACE2 親和性に対する突然変異の影響が系統的に分析されてきました 9,12。 ただし、これらのアプローチは、特定の遺伝的背景に対する単一の突然変異の影響に焦点を当てています。 したがって、それらは既存の変異体からの進化の最初のステップを理解するのには役立ちますが、複数の変異がより長い進化の軌跡にわたってどのように相互作用するかを説明することはできません。 したがって、オミクロンで観察されたような変異の組み合わせがどのように相互作用して免疫を回避し、ACE2に対する強い親和性を維持するのかは依然として不明である。 この疑問に対処するために、我々はコンビナトリアルアセンブリアプローチを使用して、Omicron BA.1 RBD の 15 個の変異のすべての可能な組み合わせ (合計 215 = 32,768 個の変異体) を含むプラスミドライブラリーを構築しました。 このライブラリーは、これまでのウイルスタンパク質の組み合わせ的に完全なライブラリーとしては最大のものであり、武漢 Hu-1 とオミクロン BA.1 RBD の間で考えられるすべての進化的中間体が含まれています。 我々は、このプラスミド ライブラリを標準的な酵母ディスプレイ株に形質転換し、各細胞がその細胞内のプラスミドに対応する単一の単量体 RBD バリアントをディスプレイする酵母ライブラリを作成しました。 次に、ハイスループットのフローサイトメトリーおよびシーケンスベースの方法である Tite-Seq を使用して 13,14 (「方法」を参照、補足図 1A)、32,768 個の RBD バリアントすべてのヒト ACE2 に対する結合親和性 KD,app を測定しました。並行して。

私たち自身による以前の研究14および他の研究9、13、15と一致して、Tite-Seq測定は再現性が高く（SEMは0.2 log KD、3回の測定間の適用）、独立した低スループット測定と一致していることがわかりました（「方法」を参照）。補足図 1b–f)。 ゲーティング戦略の違いにより、結合親和性の測定には以前の研究9との体系的な違いがわずかにありますが、相対的な親和性は2つのデータセット間で一貫していることに注意してください（補足図1f）。 さらに、RBD発現レベルの変動が最小限であることがわかり、コンビナトリアルライブラリ全体のKD,appを推測することができます（「方法」を参照、補足図3）。

武漢 Hu-1 とオミクロン BA.1 の間の 32,768 個の RBD 中間体はすべて、KD,app が 0.1 μM から 0.1 nM の範囲で、ACE2 に対して検出可能な親和性を持っていることがわかりました（図 1a および補足図 1。https://desai を参照） -lab.github.io/wuhan_to_omicron/ (対話型データ ブラウザーの場合)。 以前の研究10と一致して、BA.1 RBDは武漢Hu-1と比較して結合親和性のわずかな（Tite-seqおよび同質遺伝子測定の両方で3倍）改善を示します（補足図2）。 しかし、中間 RBD 配列のほとんど (約 60%) は、実際には、祖先武漢 Hu-1 RBD よりも ACE2 に対して弱い結合親和性を示します。 実際、武漢 Hu-1 から Omicron BA.1 への経路には、ACE2 親和性を低下させるステップが少なくとも 1 つ含まれていません。 これは主に、BA.1 変異の大部分が、ほとんどの遺伝的背景において ACE2 親和性に中立または悪影響を与えるためです (図 1b)。 これは特に K417N、G446S、Q493R、G496S、および Y505H に当てはまり、そのうち 4 つはさまざまなクラスのモノクローナル抗体からの回避に関与していることが知られています 16、17、18。

a 試験したすべての N=32,768 RBD 遺伝子型にわたる ACE2 に対する結合親和性の分布。 バインディング親和性は -logKD,app として表示されます。 青と赤の縦線は、それぞれ武漢 Hu-1 とオミクロン BA.1 の -logKD,app を示します。 b 他の14座位における考えられるすべての遺伝的背景にわたる、ACE2親和性（突然変異に起因する-logKD,appの変化として定義される）に対する各突然変異の影響の分布。 黒い線分は効果分布の 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルを示し、点は分布平均、n=16384 のバックグラウンドを表します。 青と赤の点は、それぞれ武漢 Hu-1 と最も変異した背景に対する影響を示します。 c Omicron BA.1 変異の数によってグループ化された結合親和性の分布。 武漢 Hu-1 変異体の結合親和性は水平の破線で示されています。 ボックスは 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルの間の範囲に対応し、ひげは四分位間の範囲の 1.5 倍を超えない最大/最小値まで伸びます。

多くの BA.1 変異は平均して ACE2 親和性を低下させますが、これらの変異間の相互作用により、祖先武漢 Hu-1 株と比較して BA.1 に対する ACE2 親和性が向上します。 つまり、他の変異がほとんど存在しない場合、変異はACE2親和性にとってより有害になる傾向がありますが、他の複数の変異が存在する場合は中立になるか、さらには有益になる傾向があります（図1c、補足図4）。 これと一致して、我々は、15のRBD変異のほとんどが武漢Hu-1背景（そして多くの場合、他のほとんどの背景でも同様）におけるACE2親和性を低下させるものの、最も変異が多い地域ではすべて有害性が低下するか、有益になることさえあることを発見した。背景（図1b）。 このパターンは、ACE2 親和性を個別に低下させる非常に多くの変異を含んでいるにもかかわらず、BA.1 RBD が ACE2 に対してより強い親和性を持つ理由を説明しています。その有害な影響は、他の変異との代償的なエピスタティック相互作用によって緩和されます。

突然変異の影響と相互作用を系統的に分析するために、エピスタシスの標準的な生化学モデル 19 をデータに当てはめました。 これにより、測定された -log(KD,app) (結合の自由エネルギー ΔG に比例すると予想されます)20,21 が、単一の突然変異、ペアごとのエピスタシス、およびより大きな間の高次のエピスタシス相互作用による影響の合計に分解されます。突然変異のセット (5 次で切り捨てられています。補足図 5、「方法」を参照)。 具体的には、配列 s の結合親和性を次のように書きます。

ここで、 \({C}_{i}\) には、 \(i\) の突然変異と、 \({x}_{c,s}\) は、配列 \(s\) に \(c\) のすべての突然変異が含まれている場合は 1 に等しく、そうでない場合は 0 に等しくなります (メソッドを参照。\(c\ のすべての係数) ) \(i\) 突然変異を持つものは i 次係数と呼ばれます)。 このモデルは、統計 (補足図 6) および global22 (補足図 7) エピスタシスの代替モデルに匹敵する係数を生成します。 一般に、個々の変異の一次効果の大きさ（図2a）は、対応する残基のACE2接触表面積（図2b、c）と相関しており、隣接する残基はペアごとに強い影響を与える可能性が高いことがわかります。以前の研究から予想されるように、相互作用（図2e）。

a 最適なエピスタティック相互作用モデルの一次効果 (最大 5 次)。 エラーバーはモデルの適合からの標準誤差を表し、平均値 n=16,384 を中心にしています。 b Omicron BA.1 RBD と ACE2 受容体の共結晶構造 (PDB ID 7WPB)。 変異残基は、(a) のように色の付いた球として示されています。 c 対応する BA.1 RBD 残基と ACE2 の間の接触表面積に対してプロットされた各変異の一次効果。 突然変異は (a) のように色付けされます。 一次効果と接触表面積の間のスピアマンの順位相関係数 (rs) が左上に示されています。 d 2 次のエピスタティック相互作用係数と高次の相互作用係数。 各変異について、高次の相互作用係数 (ヒート マップ プロットの下部に表示) は、変異に関係するすべての 3 次および 4 次の相互作用係数を合計することによって計算されます。 e それぞれのアルファ炭素間の距離に対してプロットされたペアワイズ相互作用係数。 (d) のように、突然変異はペアごとの係数によって色付けされます。 スピアマンの順位相関係数 (rs) は左上に示されています。

我々の推測したペアワイズ係数と高次係数は、強力な代償相互作用が親和性低下変異の影響を相殺することを明らかにしています（図2d）。 これらの相互作用の大きさは一次効果のそれに匹敵し、エピスタシス項を除外すると予測される親和性の一貫した過小評価につながるため、このエピスタシスは圧倒的にポジティブです（補足図8）。 この強い陽性エピスタシスは、ACE2 親和性を低下させる変異が、他の変異を含むバックグラウンドでは悪影響が少なくなることを意味します。 たとえば、Q498R の負の一次効果は、近くの変異 N501Y との相互作用によって完全に逆転します。 このペアごとの相互作用は、代償性エピスタシスの例として以前の研究 8、11、24 で強調されています。 さらに、Q498R、G496S、N501Y、およびY505H間のさらに強い正の相互作用（3次効果および4次効果とともに）を含む、他の相互作用する多数の変異を特定しました（図2d）。 実際、ACE2 親和性は、より多くの重要な高次相互作用の影響を受け、そのほとんどにはこれら 4 つの変異が含まれます (5 次まで、補足データ 1)。

我々のエピスタシス分析により、このような高次の代償性エピスタシスにより、抗体エスケープに関与する変異によるACE2親和性への強力な悪影響が排除されることが明らかになった。 特定の有益な変異（特に N501Y）と免疫回避変異の間のこの補償は、以前の研究で観察されています 8、25、26、27。 今回我々は、このエピスタシスの範囲と、それによるRBD配列-親和性ランドスケープ全体の形成におけるその影響を定量化する。 具体的には、以前の研究では、5 つの BA.1 変異 (K417N、G446S、E484A、Q493R、および G496S) が抗体エスケープの促進に特に強い効果があることが示されています 4,17,18。 これらの変異はすべて、平均的にも武漢 Hu-1 バックグラウンドでも個別に ACE2 に対する親和性を低下させます (E484A を除く、図 1b、2a、3a)。5 つすべての組み合わせは非常に有害です (図 3a、b)。 しかし、Q498RとN501Yのペアによる強力な高次エピスタシスはこれを軽減します。N501YまたはQ498Rのいずれか単独では5つのエスケープ変異のコストが減少し、両方の組み合わせはこれらの有害な影響をほぼ完全に補います（図3b）。 これらの回避変異は他の変異との相互作用からも恩恵を受けますが（補足図9）、N501YとQ498Rが代償効果の大部分を占めます。 強力な代償相互作用もY505Hの有害な影響を軽減することに注目します（図3c）。 この変異が抗体回避に強く関与していることはこれまで示されていなかったが、我々が観察した代償パターンは、この変異が何らかの形で機能的に関連している可能性を示唆している。

a 抗体回避に強い影響を与える変異を含む変異体に対する ACE2 結合親和性: K417N、G446S、E484A、Q493R、および G496S を代償性変異 (Q498R および N501Y) の存在によってグループ化しました。 青（それぞれ赤）の破線は、武漢 Hu-1（それぞれオミクロン BA.1）の ACE2 結合親和性を示します。 ボックスは四分位範囲を表します。 b 代償性変異（Q498RおよびN501Y）の存在によってグループ化された、選択されたエスケープ変異のいずれか1つ（またはすべて）を含むバリアントのACE2結合親和性の変化。 破線は、親和性の変化がないことを示します。 ボックスは四分位範囲を表します。 c Y505Hおよび抗体エスケープ変異を含む変異体に対するACE2結合親和性は(a)のように示されています。

我々が観察した広範なエピスタシスは、これら 15 個の変異それぞれの個々の効果、およびそれらの間のペアごとの相互作用が、他のウイルス系統では異なる可能性が高いことを意味します。 しかし、以前の研究では、上記の抗体エスケープ変異（K417N、G446S、E484A、Q493R、およびG496S）が、他のいくつかの変異体（アルファ、ベータ、イータ、デルタを含む）でも同様にACE2親和性を低下させることが示されています8。 この結果と一致して、これらの変異は、ACE2親和性に対して負の一次効果があることが判明した他の変異とともに、SARS-CoV-2の系統全体でめったに発生しないことがわかります（図4a）。 これは、ヒト ACE2 に対する親和性の維持がウイルスの適合性の重要な側面である可能性が高いことを示唆しているため、通常、これらの変異は選択されません。 同様に、N501Yとのエピスタティック相互作用によって補償される、ACE2親和性に負の影響を与える変異は、N501Yを持たない株と比較して、N501Yを有する株ではSARS-CoV-2系統全体で豊富になる傾向があることがわかりました（図4b;図4b;他のペアごとの相互作用は同時発生することがあまりにまれなのでテストできません)。 これはさらに、我々が観察したペアワイズエピスタティック相互作用の少なくとも一部は他のバックグラウンドにも存在し、ウイルスの進化がACE2親和性の低下を補う方向に進んできたことを示唆している。

a GISAID で入手可能な SARS-CoV-2 配列全体にわたる各変異の発生頻度 (「方法」を参照) を、データ内の ACE2 親和性に対する平均効果の関数として表したもの。 エラーバーは効果の大きさの標準偏差を示し、平均値を中心にしています (n=16384 バックグラウンド)。 スピアマンの順位相関係数 (rs) は左上に示されています。 (b) GISAID で入手可能な SARS-CoV-2 配列全体で N501Y と同時発生する変異の正規化頻度 (各変異が N501Y と同じ分岐で発生する頻度に基づいて計算され、全体の頻度で正規化されています。「方法」を参照) ）N501Yの存在下でのACE2親和性に対するそれらの効果の違いの関数として。 エラーバーは効果の標準偏差を示し、平均値を中心にしています (n=8096 バックグラウンド)。 スピアマンの順位相関係数 (rs) は左上に示されています。 c ランダムに選択された 100 個の経路（15 個の変異すべてを含む）の ACE2 親和性の軌跡。抗体回避に強い影響を与える変異（K417N、G446S、E484A、Q493R、および G496S）および代償性の有無の関数として示されています。突然変異 Q498R および N501Y (色付きで表示)。 各軌跡は、武漢 Hu-1 遺伝子型から始まりオミクロン BA.1 で終わる、考えられる突然変異の順序を表しています。

まとめると、これらの結果は、BA.1 における抗体回避の進化が、この系統に特有の他の多数の変異との代償的相互作用により、ACE2 への結合を破壊することなく可能であったことを示唆しています。 これらの選択圧と上位相互作用の兆候はウイルス系統全体に存在し 28 、抗体エスケープ変異体は他の変異の組み合わせによって補償された可能性がありますが、相互作用する代償的変異のこの特定の組み合わせを蓄積したのは BA.1 系統だけです。

また、我々の結果は、オミクロン BA.1 で観察された免疫回避表現型が、当時広く流通していたデルタ変異体内に蓄積した変異の結果として生じなかった理由についての洞察も提供します。 具体的には、免疫回避とACE2への親和性維持の両方に必要な複数の変異の組み合わせ（図4c）は、感染のボトルネックとおそらく両方の機能に対する強い選択圧力の間にわずかな変異が関与する急性感染症の状況内で蓄積された可能性は低い29。 対照的に、慢性感染症（免疫不全宿主など）では、集団サイズが大きく選択圧力が緩和されているため、ACE2親和性の維持と中和抗体の回避の両方に必要な多くの変異が蓄積する可能性があります30、31。 あるいは、以前に推測されているように 32,33 、BA.1 は動物の宿主の中で進化した可能性があり、そこでは選択圧力も緩和された可能性があります。 どちらのシナリオでも、代償性突然変異が免疫回避突然変異に先行しており、ACE2親和性に対する有害な影響が最小限に抑えられている可能性があります。 あるいは、ACE2に結合するための緩和された選択により、免疫逃避変異が許容される環境が生み出され、その後の代償によって変異が他の宿主に広がることを可能にした可能性がある。 2つの免疫回避突然変異（G446SおよびG496S）がBA.1進化の後期に発生するため（そしてBA.2系統とは共有されないため）、系統解析は前者の可能性をある程度裏付けています。補足図10）。 さらに、ACE2親和性に基づく強力な選択モデルは、系統発生で観察されたように、3つのBA.1特異的変異が進化の後半に現れることを好みます（補足図11）。 突然変異の正確な順序に関係なく、ウイルス集団の規模が大きいことと慢性感染症の選択圧力の緩和により、BA.1 が ACE2 親和性を維持しながら中和抗体を回避するために必要ないくつかの突然変異の固定に役立つ条件が生み出された可能性があります。

我々は、我々の研究が 1 つのタンパク質の特定領域内の 15 の変異に限定されており、したがって Omicron BA.1 系統に存在する RBD 以外の多くの他の変異との潜在的な相互作用を無視していることを強調します。 しかし、我々は、ACE2親和性がどのように維持されるかを説明するにはRBD変異間の相互作用だけで十分であることを発見したが、これは単一の変異体のデータだけでは明らかではない。 さらに、ACE2 親和性における正の相互作用が他の表現型に負の影響を与える可能性があることにも注目します。 たとえば、これらの相互作用は免疫回避を阻害する可能性があるため、これらの相互作用が免疫回避に及ぼす影響もマッピングする必要があります。 さらに、スパイクタンパク質の発現と安定性もウイルスの進化において重要な役割を果たしている可能性があります。 データの中にこの傾向のヒントがいくつか見つかります。 たとえば、我々は、酵母におけるRBD発現を改善するS371L、S373P、およびS375Fの間の重要な相乗的相互作用を特定しており、この一連の変異がRBD34のより密に詰まったダウンコンフォメーションの安定化と関連していることを示した以前の研究と一致しています（補足）図4）。 これを超えて、他の多くの表現型も関連している可能性があります。

これらの注意点にもかかわらず、我々の結果は、ウイルス進化における重要な出来事がエピスタシスの高次パターンに依存する可能性があることを示しています。 私たちは、これらのエピスタティックな相互作用はほぼ完全に相乗的、または代償的であり、免疫が制約された状況で進化するウイルスの一般的な新たな特徴である可能性があるパターンであることを発見しました。 これは、免疫逃避や宿主の切り替えなど、多数の突然変異を伴う複雑な適応イベントにとって特に重要である可能性があります。 したがって、ウイルス進化の将来を予測するには、単一変異のハイスループットスクリーニングを超えて、組み合わせ配列空間をより包括的に分析する必要があります。 重要な課題は、この配列空間の広大さであり、そのため徹底的な探索が困難になっています。 しかし、ここで紹介したような特定の組み合わせのランドスケープを生成することは、複雑な環境におけるウイルスの進化を形作るエピスタシスの一般的なパターンを明らかにするのに役立つ可能性があります。

Wuhan Hu-1 および Omicron BA.1 変異体のクローン酵母株を生成するために、対応する RBD gblock (IDT、補足データ 2) を pETcon 酵母表面ディスプレイ ベクター (プラスミド 2649; Addgene、マサチューセッツ州ウォータータウン、#166782) にクローニングしました。 ) ギブソンアセンブリ経由。 gblock の配列は酵母用にコドン最適化されました (Twist Bioscience アルゴリズムを使用)。 コドンの最適化が表示効率に大きな影響を与えることがわかりました。 さらに、ライブラリー構築 (後述) のために、部位特異的突然変異誘発によってプラスミドから既存の 2 つの Bsa-I 部位を削除しました (Agilent、カリフォルニア州サンタクララ、#200521)。 クローン株の作製では、メーカーのプロトコルに従って、Gibson Assembly 製品を NEB 10-ベータ エレクトロコンピテント大腸菌細胞 (NEB、マサチューセッツ州イプスウィッチ、#C3020K) に形質転換しました。 37℃で一晩インキュベートした後、細胞を回収し、得られたプラスミドを精製してサンガー配列を決定しました。 我々は、Gietz および Schiestl36 の記載に従って、正しい配列を含むプラスミドを AWY101 酵母株 (Eric Shusta 博士からの寄贈) 35 に形質転換しました。 形質転換体を SDCAA 寒天 (アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない 1.71 g/L YNB [Sigma-Aldrich #Y1251]、5 g/L 硫酸アンモニウム [Sigma-Aldrich #A4418]、2% ブドウ糖 [VWR #90000–904]) 上にプレーティングしました。 ]、5 g/L Bacto カザアミノ酸 [VWR #223050]、100 g/L アンピシリン [VWR #V0339]、2% Difco Noble Agar [VWR #90000–774]) を加え、30 °C で 48 時間インキュベートしました。 いくつかのコロニーをSDCAA寒天上に再画線し、再び30℃で48時間インキュベートした。 クローン酵母株を採取し、接種し、液体 SDCAA (アミノ酸 VWR #90004-150 を含まない 6.7 g/L YNB)、5 g/L 硫酸アンモニウム (Sigma-Aldrich #A4418)、2% ブドウ糖 (VWR # 90000–904)、5 g/L バクト カザアミノ酸 (VWR #223050)、1.065 g/L MES 緩衝液 (Cayman Chemical、ミシガン州アナーバー、#70310)、100 g/L アンピシリン (VWR # V0339)) (30 ℃) °Cで保存し、5%グリセロールと混合して-80°Cで保存します。

Golden Gate 組み合わせアセンブリ戦略を使用して RBD バリアント ライブラリを生成しました。 まず、RBD 配列を、90 ～ 131 bp の範囲で、それぞれが 1 ～ 4 個の変異を含む、ほぼ同じ長さの 5 つのフラグメントに分割しました。 各フラグメント配列の両端に BsaI 部位とオーバーハングを導入しました。 これらのオーバーハングには BsaI 切断部位が含まれており、これにより 5 つのフラグメントがプラスミド骨格内で適切な順序で独自に集合できるようになります。 n 個の変異を持つ各フラグメントについて、PCR によってフラグメントを生成するか (フラグメント 1 ～ 4)、IDT から個々の DNA 二重鎖 (フラグメント 5) を購入することにより、2n フラグメント バージョンを生成しました。 これらの順列により、ライブラリー内にすべての可能な突然変異の組み合わせが確実に含まれるようになりました。 フラグメント 2 では、K417N 変異に対応する K378 残基上の同義置換も含めました。 この置換により、アンプリコン ライブラリを Illumina Novaseq SP (2x250bp) で配列決定できるようになります。 PCR による dsDNA 生成の場合、断片に含まれる変異が 3' または 5' 末端に近くなるように断片を設計しました。 この設計により、PCR 中に選択された変異、BsaI 部位、および固有のオーバーハングをプライマーに同時に含めて導入することが可能になりました。 各フラグメントの各バージョンを個別に生成し (合計 28 PCR 反応、補足データ 3)、各フラグメントの生成物を等モル比でプールしました。 さらに、5 番目のフラグメントをコードする購入した 16 個の DNA 二重鎖すべてを等モル比でプールしました。 次に、5 つのフラグメント プールをプールして最終的なフラグメント ミックスを作成しました。 Golden Gate 反応では、各フラグメントのバージョンがランダムな組み合わせでライゲーションされ、ほぼ同じ頻度で存在するすべての配列が生成されます。

フラグメント ミックスに加えて、ゴールデン ゲート反応用に 4 つのバージョンのプラスミド バックボーンを準備しました。 各バージョンには、変異 N501Y と Y505H の組み合わせが含まれています。 アセンブリの前に、フラグメント挿入領域の代わりに、BsaI 部位に隣接するカウンター選択マーカー ccdB を導入しました (補足データ 3)。 メーカー推奨プロトコールに従い、Golden Gate Assembly Mix (NEB、マサチューセッツ州イプスウィッチ、#E1601L) を使用し、断片挿入プールとプラスミド骨格のモル比 7:1 で Golden Gate クローニングを実行しました。 我々は、アセンブリ生成物を 6 × 25 μL 細胞アリコート中の NEB 10 ベータ エレクトロコンピテント大腸菌細胞に形質転換しました。 次に、回収した各細胞培養物を、0.3% SeaPrep アガロース (VWR、ラドナー、ペンシルバニア州 #12001–922) を含む 100 mL の溶融 LB (1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、1% NaCl) に移し、薄層に広げました。 1 L バッフル付きフラスコ (深さ約 1 cm) に入れます。 混合物を4℃で3時間置き、その後37℃で18時間インキュベートした。 アリコート全体で合計 300 万個の形質転換体を観察しました。 プラスミドライブラリーを単離するために、フラスコを１時間振盪して混合し、標準プラスミドマキシプレップ（Zymo Research、カリフォルニア州アーバイン、D4201）用に細胞をペレット化し、そこから＞90μgの精製プラスミドを得た。

次に、精製したプラスミドライブラリーを上記のようにAWY101細胞に形質転換しました。 溶融したSDCAAアガロースゲル（アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない1.71 g/L YNB（Sigma-Aldrich #Y1251）、5 g/L 硫酸アンモニウム（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、#A4418））で形質転換体を回収しました。 2% ブドウ糖 (VWR #90000–904)、5 g/L バクト カザミノ酸 (VWR #223050)、0.35% SeaPrep アガロース (VWR #12001–922) を含む 100 g/L アンピシリン (VWR # V0339))薄い層（深さ約1cm）。 混合物を 4 °C で 3 時間置き、その後 30 °C で 48 時間インキュベートしました。 5 つのアリコートから、約 120 万個のコロニーが得られました。 フラスコを 1 時間振盪して混合した後、液体 SDCAA の 5 mL チューブで細胞を 5 世代増殖させ、飽和培養物を 5% グリセロールを添加した 1 mL アリコートで -80 °C で保存しました。

Tite-Seq は前述のように実行されました 36。 異なる日に 3 回の反復アッセイを実行しました。 最初の 2 つの複製では、ライブラリー変異体のごく一部に、意図した変異 (E484A) ではなくオフターゲット変異 (E484W) が含まれていました。 これらの変異体はデータ分析から削除され、3 回目の複製では、意図した変異 (E484A) を含む変異体がライブラリーに追加されました。

まず、酵母 RBD ライブラリー、および武漢 Hu-1 および Omicron BA.1 クローン株を、対応するグリセロール ストック (-80 °C で保存された 5% グリセロールを含む飽和培養物) 150 μL を 5 mL SDCAA に接種して解凍しました。 30℃で20時間。 翌日、酵母培養物を 5 mL SGDCAA (アミノ酸 VWR #90004-150 を含まない 6.7 g/L YNB)、5 g/L 硫酸アンモニウム (Sigma-Aldrich #A4418)、2% ガラクトースで OD600 = 0.67 まで希釈しました。 (Sigma-Aldrich #G0625)、0.1% ブドウ糖 (VWR #90000–904)、5 g/L バクト カザミノ酸 (VWR #223050)、1.065 g/L MES 緩衝液 (Cayman Chemical、ミシガン州アナーバー、#70310) 、100 g/L アンピシリン (VWR # V0339)) を加え、室温で 16 ～ 20 時間回転させました。

一晩誘導した後、酵母培養物をペレット化し、0.01% PBSA (VWR #45001–130; GoldBio、セントルイス、ミズーリ州、#A-420–50) で 2 回洗浄し、OD600 が 1 になるまで再懸濁しました。合計 500約700μLのOD1酵母細胞を、12のACE2濃度（10-12.5〜10-7Mにわたる半対数増分）のそれぞれでビオチン化ヒトACE2（Acrobiosystems #AC2-H2H82E6）で標識し、リガンドの枯渇を制限するように容量を調整しました。影響は 10% 未満です (50,000 表面 RBD/細胞を想定)。 酵母-ACE2混合物を室温で20時間インキュベートし、回転させました。 インキュベーション後、酵母-ACE2複合体を4℃、3000×gで10分間遠心してペレット化し、0.5% PBSA + 2 mM EDTAで2回洗浄し、その後ストレプトアビジン-RPE（1:100、Thermo Fisher #）で標識しました。 S866) および抗 cMyc-FITC (1:50、Miltenyi Biotec、マサチューセッツ州サマービル、#130-116-485) を 4 °C で 45 分間使用しました。 この二次標識の後、酵母を0.5% PBSA + 2 mM EDTAで2回洗浄し、選別するまで暗所で氷上に放置した。

405 nm、440 nm、488 nm、561 nm、および 635 nm のレーザーと 85 ミクロンの固定ノズルを備えた BD FACS Aria Illu で酵母ライブラリー複合体をソートしました。 スペクトルの重複効果を最小限に抑えるために、単一蛍光団コントロールを使用して FITC と PE の間の補償を決定しました。 単一細胞は、最初に FSC 対 SSC によってゲートされ、次に発現 (FITC) または結合 (PE) 蛍光のいずれかによって分類されました。 各サンプルについて少なくとも 100 万個の細胞が選別されました。 発現ソートでは、シングレット (FSC 対 SSC に基づく) が 8 つの等価な対数間隔の FITC ビンにソートされました。 結合ソートでは、FITC+ 細胞を 4 つの PE ビンにソートしました (PE- 集団はビン 1 を構成し、PE+ 集団は対数間隔で等間隔​​に配置された 3 つのビン 2 ～ 414、37 に分割されました)。 1% BSA を添加した 1 mL YPD で満たし、回収後、細胞を 3000 xg で 10 分間遠心してペレット化し、4 mL SDCAA に再懸濁しました。培養物を対数増殖期後期 (OD600 = 0.9-) まで 30°C で回転させました。 1.4）。

1.5 mLの後期対数酵母培養物をペレット化し、抽出前に少なくとも6時間-20℃で保存しました。 製造業者の指示に従って、Zymo Yeast Plasmid Miniprep II (Zymo Research # D2004) を使用して酵母ディスプレイプラスミドを抽出し、17 μL の溶出緩衝液で溶出した。 RBD アンプリコン配列決定ライブラリーは、以前に記載されているように 2 ステップ PCR によって調製されました 14,38。 最初の PCR では、PCR 増幅の偏りを最小限に抑えるために、7 つの増幅サイクルを通じて固有分子識別子 (UMI)、インライン インデックス、および部分的な Illumina アダプターが配列ライブラリーに追加されました。 メーカーのプロトコール（NEB # M0491L）に従って、Q5 ポリメラーゼを用いた 25 μL 反応容量中の鋳型として 5 μL プラスミド DNA を使用しました。 反応は以下のプログラムを使用してサーモサイクラー内でインキュベートされました: 1. 98 °C で 60 秒、2. 98 °C で 10 秒、3. 66 °C で 30 秒、4. 72 °C で 30 秒、5. GOTO 2、6x、6. 72 °C で 60 秒。 反応が完了した直後に、25 μL の水を反応液に加え、1.2X 磁気ビーズのクリーンアップを実行しました (Aline Biosciences #C-1003–5)。 次いで、精製産物を35μLの溶出緩衝液中で溶出した。 2 回目の PCR では、残りのイルミナアダプターとサンプル固有のイルミナ i5 および i7 インデックスが 35 増幅サイクルを通じて追加されました (プライマー配列の補足データ 4 ～ 5)。 製造業者の指示に従って、Kapaポリメラーゼ(Kapa Biosystems #KK2502)を使用して、総量50μLの精製PCR1産物33μLを鋳型として使用した。 この 2 番目の反応をサーモサイクラーで次のプログラムでインキュベートしました: 1. 98 °C で 30 秒、2. 98 °C で 20 秒、3. 62 °C で 30 秒、4. 72 °C で 30 秒、5 . GOTO 2、34x、6. 72 °C で 300 秒。 得られたシーケンシングライブラリーを 0.85X Aline ビーズを使用して精製し、アンプリコンのサイズが 1% アガロースゲルで実行することによって約 500 bp であることを確認し、アンプリコン濃度を蛍光 DNA 結合色素 (Biotium、カリフォルニア州フリーモント、#31068) によって定量しました。 、メーカーの指示に従って）Spectramax i3 で。 次に、ソートされた細胞の数に応じてアンプリコン ライブラリをプールし、両面 Aline ビーズ精製 (0.5 ～ 0.9 X) によってこのプールをさらにサイズ選択しました。 最終的なプール サイズは、Tapestation 5000 HS および 1000 HS によって検証されました。 最終的な配列決定ライブラリーを Qubit 蛍光光度計で定量し、10% PhiX を使用した Illumina NovaSeq SP で配列決定しました。

生の逆多重化シーケンスリードを処理して、インデックスと変異部位を特定して抽出しました。 そのために、最初にすべての fastq ファイルを解析し、Python ライブラリ regex40 を使用してインライン インデックス、UMI、およびシーケンス読み取りに従って読み取りを分離する、snakemake パイプライン 39 を開発しました。 10% bp ミスマッチ許容範囲内でリード全体に一致する配列 (変異部位の塩基に制限はありません) を受け入れました。 次に、不正なインライン インデックス (対応する i5/i7 インデックスに従って) を破棄し、読み取り配列をバイナリ遺伝子型 (各変異位置の武漢 Hu-1 対立遺伝子の場合は「0」、Omicron BA.1 対立遺伝子の場合は「1」) に解析しました。 突然変異部位にエラーがあるリード（つまり、Wuhan Hu-1 対立遺伝子または Omicron BA.1 対立遺伝子のいずれにも一致しない）は破棄されました。 最後に、各遺伝子型の個別の UMI の数を数え、すべてのサンプルからの遺伝子型数を 1 つの表に照合しました。 すべての反復の平均カバレッジは約 150 倍でした。

各遺伝子型の結合解離定数 KD,app を適合させるために、前述と同じ手順に従いました 39。 簡単に言うと、シーケンスとフローサイトメトリーのデータを使用して、各濃度 \(c\) における各遺伝子型 \(s\) の平均対数蛍光を計算しました。

ここで、 \({F}_{b,c}\) は濃度 \(c\) におけるビン \(b\) の平均対数蛍光であり、 \({p}_{b,s\vee c} \) は、濃度 \(c\) でビン \(b\) に分類される遺伝子型 s の細胞の推定割合です。 \({p}_{b,s\vee c}\) は、読み取りカウントから次のように推定されます。

ここで、 \({R}_{b,s,c}\) は、濃度 \(c\) のビン \(b\) で見つかった遺伝子型 s からのリード数です。一方、 \({C}_{ b,c}\) は、濃度 \(c\) でビン \(b\) に分類された細胞の数を指します。

平均ビン推定の不確実性を伝播するために、次の式を使用しました。

ここで \(\delta {F}_{b,c}\) は、濃度 \(c\) でビン \(b\) に分類された細胞の対数蛍光の広がりです。 以前に調査したように、\(\delta {F}_{b,c}\estimate \sigma {F}_{b,c}\) を推定するだけで、それぞれの範囲内の対数蛍光で観察された変動を捉えるのに十分であることがわかりました。置き場。 対照的に、 \({p}_{b,s\vee c}\) の誤差はサンプリング誤差から生じます。読み取りカウントが十分に高い場合、これはポアソン過程として近似できます。

したがって、次のようになります。

最後に、ヒル関数の対数を関数として平均対数蛍光\({\bar{F}}_{s,c}\)にフィッティングすることにより、各バリアントの結合解離定数 (KD,s) を推測しました。 ACE2 濃度 \(c\):

ここで、 \({A}_{s}\) は ACE2 飽和における蛍光の増加であり、 \({B}_{s}\) はバックグラウンド蛍光レベルです。 フィッティングは、Python パッケージ scipy.optimize の Curve_fit 関数を使用して実行されました。 すべての遺伝子型にわたって、\({A}_{s}\) の値は 102-106、\({B}_{s}\) は 1-105、KD,s に妥当な限界を与えました。 10−14−10−5となります。 次に、適合度の低い値 (\({r}^{2}\, < \, 0.8\)) を削除した後、3 回の反復で推定された KD,s 値を平均しました。

ここでのアプローチは、次の式で平均ビンを使用してこのヒル関数を直接適合させる以前の研究 9,41 とは若干異なることに注意してください。

推定された平均蛍光値を使用するのではなく。 ビン数は平均蛍光ではなく平均対数蛍光に比例するため、平均ビン値を使用するとバイアスが生じます。 したがって、この以前の方法で推定された KD,s 値は正確ではありません。 ただし、私たちの測定範囲では、これらの値は依然として測定値と線形相関があります（補足図1eを参照）。

低スループット検証用に 10 個の特異的 RBD クローンを選択することにより、ハイスループットの結合親和性メソッドを検証しました: Wuhan Hu-1、Omicron、5 つの単一変異体 (K417N、S477N、T478K、Q498R、N501)、2 つの二重変異体 (Q498R/ N501Y および E484A/Q498R）、および 4 つの変異を含む 1 つの遺伝子型（K417N/E484A/Q498R/N501Y）。 各同質遺伝子滴定曲線について、同じ標識戦略に従い、目的の配列のみを表示する同質遺伝子酵母株について 10-12-10-7 M の範囲の濃度で ACE2 を滴定しました。 平均対数蛍光は、BD LSR Fortessa セル アナライザーを使用して測定されました。 各濃度のこれらの分布の平均と分散を直接計算し、式（上に示した）を使用してそれらを使用して-log10（KD）の値を推測しました（補足図1を参照）。

まず、変異の組み合わせの影響が配列の表現型に加算される単純な線形モデルを使用しました。 結合親和性の対数 \({{\log }}_{10}\left({K}_{D,s}\right)\) は自由エネルギーの変化に比例するため、相互作用のないモデルでは、加算的に結合します41。 完全な K 次モデルは次のように記述できます。

ここで、 \({\beta }_{c}\) は、突然変異 \(c\) の組み合わせの係数 (\(i=1\) の場合は単一突然変異係数、それ以外の場合は相互作用係数) を表し、次のすべての組み合わせが含まれます。 i は変異であり、シーケンスに 0 と 0 へのすべての変異が含まれる場合は 1 に等しく、そうでない場合は 0 になります。 この選択は「生化学的」または「局所的」エピスタシスと呼ばれ42、本文でも使用されています。 「統計的」または「アンサンブル」エピスタシスと呼ばれる別のオプションは、係数を次のように置き換えることで構成されます。 この「統計的」モデルでは、ベースラインは集団の平均親和性であり、突然変異の一次効果は親和性に対する平均効果に対応します。 この分析の結果と生化学モデルとの違いを補足図6に示します。

K の最適な値を選択するには、Phillips and Lawrence et al., 202142 で詳述されている方法に従います。簡単に説明すると、10 分割相互検証を使用して、K ≤ 6 のすべての値をテストします。K の各値について、データは 10 に分割され、10 のサブデータセットのそれぞれが、残りのデータでトレーニングされたモデルのテスト セットとして使用されます。 10 個のテスト データセットすべてで平均した予測パフォーマンス (R²) を最大化する K の値を選択しました。 このデータセットでは、K = 5 の最適値が見つかりました (補足図 5)。 最後に、完全なデータセットに対して K=5 モデルをトレーニングして、最終的な係数を取得しました。 最終モデルのパラメーター数 (約 5000) は、観測されたデータ ポイントの数 (215 = 32768) よりもはるかに少ないです。

上で述べたように、結合親和性の対数は自由エネルギー変化、つまり膨大な量に比例します。 これは理論的には線形モデルの使用を正当化します。 それにもかかわらず、いくつかのシナリオでは、突然変異間の相互作用は、高次の多数の小さな効果の相互作用 (「特異性エピスタシス」) よりも、完全な表現型に作用する少数のパラメーターを含む非線形関数 (「全体的エピスタシス」) によってより適切に説明できる場合があります。 ）。 私たちの実装は、Sailer and Harms, 201743 によって説明されているものと似ており、Phillips and Lawrence et al., 202142 に厳密に従っています。 つまり、4 つのパラメーターを持つロジスティック関数 Φ を使用して、次の式を当てはめます。

ロジスティック関数の選択は、KD,app 分布の一般的な形式によって正当化され、KD,app が強いときにわずかに「プラトー」になります。 この効果は実験によるアーチファクト（補足図3）によって引き起こされるのではなく、「収穫逓減」エピスタシスの形態によって引き起こされます43。 実際には、パラメータは、加法 βi と非線形関数パラメータを連続的にフィッティングすることによって推定されます。 大域的なエピスタシス変換により適合度は向上しますが、低次で観察される加算係数は大きく変化しません（補足図 7）。

ACE2 と複合体を形成した Omicron BA.1 の 2.79 Å クライオ EM 構造の参照構造 (PDB ID: 7WPB) を使用しました。 図2cでは、ChimeraX44を使用してACE2とRBDの各変異残基の間の埋没表面積を測定することにより、接触表面積を決定します（埋没面積関数の測定、デフォルトのプローブ半径1.4Å）。 図 2E では、α 炭素間の距離が PyMol45 を使用して測定されています。

ACE2 結合親和性は SARS-CoV-2 変異体の適合性に影響を与えるため、その過去の軌跡を部分的に推測するために利用できます。 この情報は、系統発生情報が限られている Omicron BA.1 にとって特に重要です。 私たちのデータセットには、考えられるすべての進化中間体の ACE2 親和性が含まれているため、祖先の武漢 Hu-1 配列と Omicron BA.1 の間のすべての経路の可能性を推測できます。 これを行うには、選択モデルを選択する必要があります。 Omicron 変異体が進化した状況は不明であり、ウイルスの進化的適合性は ACE2 に結合する能力よりも複雑であり、他の多くの要因の中でも特に免疫圧、構造安定性、発現レベルも役割を果たしています 46。 さらに、復帰突然変異はウイルスの進化において一般的であり、株が急速に宿主を切り替えるか、または長期感染の一部であるかによって選択圧力が変化する可能性があります。 ここでは、ウイルス進化の非常に単純な弱い突然変異/強い選択体制を採用することを選択しました。

そのモデルでは、選択はマルコフ過程として進行し、集団は個別のステップごとに単一の突然変異を獲得する単一の配列によって特徴付けられます 31,47。 我々は、復帰突然変異（すなわち、武漢 Hu-1 アミノ酸から BA.1 アミノ酸への残基の変化）は不可能であると仮定しています。 このような配列が生成されると、それは全個体群で固定されるか、消滅するかのいずれかになります。 重要なパラメータは固定確率であり、これは元の配列と変異した配列の両方の結合親和性に依存します。 サイズ N の母集団における選択係数 σ を持つ突然変異に対して、一般的に使用される古典的な固定確率 48 を使用することを選択します。

ここで、選択係数は 2 つの配列間の対数結合親和性の差に比例します。 我々はこのモデルを「強い選択」の制限（N → ∞ および σ → ∞）で使用します。この場合、突然変異は、それが有利であるか、または残っているすべての突然変異の中でより有害ではない選択肢であるかによって固定されます。 σ と N の値が低い、より弱い選択モデルでは、選択圧力が十分に高い場合、定性的に同様の結果が得られます (補足図 11b を参照。選択圧力が十分に小さい場合、予想どおり順序はランダムになります)。 このモデルを実装するには、各残基が特定の位置に出現する確率を迅速に計算できる遷移行列アプローチを使用します。 特定の変異の順序が統計的に有意であることを検証するために、ブートストラップ法を使用し、実験測定によって得られた平均値と標準偏差を持つ正規分布からアフィニティー値をサンプリングします。 次に、前述のモデルに従って突然変異をサンプリングし、標準的な方法を使用して有意性を決定します。

高次元の結合親和性ランドスケープは、力指向のグラフ レイアウト アプローチを使用して 2 次元に投影できます (https://desai-lab.github.io/wuhan_to_omicron/ を参照)。 抗体ライブラリー内の各配列はノードであり、その単一変異の隣接配列とエッジによって接続されています。 2 つのシーケンス s と t の間のエッジには重みが与えられます。

力指向の表現では、ノードは互いに反発しますが、エッジはそれらが接続されているノードを引き寄せます。 私たちのシナリオでは、これは、類似の遺伝子型 (いくつかの変異が離れている) と類似の表現型 (結合親和性) を持つノードが 2 次元で互いに近いことを意味します。

重要なのは、これが「風景」表現ではないということです。2 点間の距離は、特定の選択モデルにおいて、ある遺伝子型から別の遺伝子型に到達するのがいかに簡単かとは無関係です。 実際には、すべてのエッジの重みを割り当てた後、Python パッケージ iGraph のレイアウト関数layout_drlをデフォルト設定で使用して、各バリアントのレイアウト座標を取得します。

SARS-CoV-2 の系統発生を分析するために (図 4a、b)、我々は、全インフルエンザ データ共有イニシアチブ (GISAID) リポジトリ 49,50,51 に寄託されたすべての SARS-CoV-2 ゲノムからの完全な RBD 配列をすべて使用しました。 GISAID Audacity の世界系統図 (EPI_SET ID: EPI_SET_20220615uq、2022 年 6 月 15 日まで GISAID で利用可能、https://doi.org/10.55876/gis8.220615uq でアクセス可能)。 私たちはツリーを枝刈りして、Wuhan Hu-1 と Omicron BA.1 の間の考えられる中間体のいずれにも一致しない RBD を持つすべての配列を削除し、Python ツールキット ete352 を使用してこのツリーを分析しました。 各突然変異がツリー内で独立して発生する回数（つまり、その突然変異を持たない親ノードのノードに突然変異が現れる頻度）を数えることによって、各突然変異の頻度を測定しました（図4a）。 図 4b では、両方の突然変異が親ノードに存在せず、子孫ノードの少なくとも 1 つに含まれている場合、2 つの突然変異を同時出現としてカウントしました。 したがって、すべての子孫における突然変異を考慮するのではなく、同じブランチに現れる突然変異に範囲を限定しています。 これにより、ノイズや不測の事態の影響を軽減できます。 たとえば、系統の初期に出現した中立突然変異は多くの子孫を残すことになり、その影響が偏る可能性があります。 同時に出現する変異の相対頻度を研究するこの戦略は、系統発生データから変異間のエピスタシスを推測する Kryazhimskiy ら 47 で開発された方法の特殊なケースです (一般的な方法は、サイズが大きいため、この特定のデータセットには適用できませんでした)。

すべてのデータ処理と統計分析は、R v4.1.053 と Python 3.10.054 を使用して実行されました。 すべての図は、ggplot255 と matplotlib56 を使用して生成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された生のシーケンシングリードは、アクセッション番号 PRJNA849979 で NCBI BioProject データベースに寄託されています。 github リポジトリ 39 https://github.com/desai-lab/compensatory_epistasis_omicron/ には、関連するすべてのメタデータ ('Titeseq/metadata') とフロー サイトメトリー fcs ファイル ('Titeseq/facs_data') が含まれています。 また、https://doi.org/10.55876/gis8.220615uq からアクセスできる、GISAID から公開されているサードパーティ データセットも使用しました。

Github リポジトリ39 https://github.com/desai-lab/compensatory_epistasis_omicron/Titeseq/ には、関連するすべての分析コードが含まれています。

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フローサイトメトリーについて支援してくれた Zach Niziolek と、有益な議論をしてくれた Desai 研究室のメンバーに感謝します。 TD はヒューマン フロンティア サイエンス プログラムの博士研究員フェローシップからの支援を認め、AMP はハワード ヒューズ医学研究所ハンナ H. グレイ博士研究員フェローシップからの支援を認め、JC は国立科学財団大学院研究フェローシップからの支援を認め、MMD は NSF-シモンズ センターからの支援を認めています。ハーバード大学における生物学の数学的および統計的分析のため、NSF 助成金第 1 号の支援を受けています。 DMS-1764269 および Harvard FAS Quantitative Biology Initiative は、NSF から PHY-1914916 を付与し、NIH から GM104239 を付与しています。 JDB は NIH/NIAID 補助金 R01AI141707 からの支援を認めており、ハワード ヒューズ医学研究所の研究者でもあります。 私たちはすべてのデータ貢献者、つまり標本の入手に責任を負う著者とその作成元研究室、および遺伝子配列とメタデータを生成し、GISAID イニシアチブを介して共有する提出研究室に感謝します。 計算作業は、ハーバード大学の FAS 科学研究コンピューティング グループの支援を受けて、FASRC Cannon クラスターで実行されました。

Alief Moulana、Thomas Dupic、Angela M. Phillips、Jeffrey Chang の著者も同様に貢献しました。

ハーバード大学有機進化生物学部、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、02138、米国

アリーフ・ムーラナ、トーマス・デュピック、アンジェラ・M・フィリップス、マイケル・M・デサイ

ハーバード大学物理学科、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、02138、米国

ジェフリー・チャン & マイケル・M・デサイ

ハーバード大学分子細胞生物学部、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、02138、米国

セラフィナ・ニエベス

生物学および生物医学、ハーバード大学医学部、ボストン、マサチューセッツ州、02115、米国

アン・A・ロフラー

基礎科学部門および計算生物学プログラム、フレッド・ハッチンソンがん研究センター、シアトル、ワシントン州、98109、米国

アリソン・J・グリーニー、タイラー・N・スター、ジェシー・D・ブルーム

ワシントン大学ゲノム科学部、シアトル、ワシントン州、98195、米国

アリソン・J・グリーニー & ジェシー・D・ブルーム

医学科学者トレーニング プログラム、ワシントン大学、シアトル、ワシントン州、98195、米国

アリソン・J・グリーニー

ハワード・ヒューズ医学研究所、シアトル、ワシントン州、98109、米国

ジェシー・D・ブルーム

NSF-Simons Center for Mathematical and Statistical Analysis of Biology、ハーバード大学、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、02138、米国

マイケル・M・デサイ

定量的生物学イニシアチブ、ハーバード大学、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、02138、米国

マイケル・M・デサイ

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概念化: AM、TD、AMP、JC、TNS、AJG、JDB、および MMD 方法論: AM、TD、AMP、JC、SN、TNS、および AJG ライブラリの設計および作成: AM、TD、AMP、JC、および AJG 実験：AM、TD、AMP、JC、AAR 検証：AM、TD、AMP、JC、SN、TNS データ解析：AM、TD、AMP、JC、SN、TNS 監修：AMP、JDB、MMD 資金調達: JDB および MMD 執筆—初稿: AM、TD、AMP、JC、および MMD 著者全員が原稿をレビューし、編集しました。

アンジェラ M. フィリップスまたはマイケル M. デサイへの通信。

AMP と MMD は、Leyden Labs に対してコンサルティングを行っているか、最近コンサルティングを行っています。 JDB は、Apriori Bio、Oncorus、Moderna、Merck に対してコンサルティングを行っているか、最近コンサルティングを行っています。 JDB、AJG、および TNS は、ウイルスの深い突然変異スキャンに関連する Fred Hutch ライセンス特許の発明者です。 他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Joachim Krug と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Moulana、A.、Dupic、T.、Phillips、AM 他。 代償性エピスタシスは、SARS-CoV-2 Omicron BA.1 における ACE2 親和性を維持します。 Nat Commun 13、7011 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-34506-z

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受信日: 2022 年 9 月 8 日

受理日: 2022 年 10 月 26 日

公開日: 2022 年 11 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34506-z

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BMC生物学 (2023)

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