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Jan 05, 2024

ダイナミックHIV

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 6393 (2022) この記事を引用

2524 アクセス

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

HIV-1 の gp160 スパイクタンパク質を標的とするワクチンは、高いウイルス変異率と構造的不正行為によって妨げられています。 gp160 の膜近位外部領域 (MPER) は、天然に存在する広範囲中和抗体 (bnAbs) の標的ですが、MPER ベースのワクチンは bnAb を生成できません。 今回は、ナノディスクに埋め込まれたスパイクタンパク質を極低温電子顕微鏡と分子動力学シミュレーションによって調査し、HIV-1に対する脆弱性を生み出す自発的な細胞外ドメインの傾斜を明らかにした。 各 MPER プロトマーは三重軸に向かって中心から放射状に広がり、直立したスパイクに閉塞された膜関連の三脚構造に貢献しますが、傾けることで反対側の MPER へのアクセスが可能になります。 4E10 bnAb Fab が結合したスパイクタンパク質の構造から、抗体が露出した MPER に結合し、それによって MPER の動態が変化し、細胞外ドメインの平均傾斜が変化し、ウイルス膜とスパイクの膜貫通セグメントに負担がかかり、その結果膜融合が解消され、将来の情報が得られることが明らかになりました。ワクチン開発。

ホモ・サピエンスの病原体としてのヒト免疫不全ウイルス 1 (HIV-1) の発生は、レトロウイルスがチンパンジーからヒトに飛び移り、その後コンゴ民主共和国で現在の流行が始まった結果、1920 年頃にコンゴ民主共和国で発生したと考えられています。 1970年代1、2。 この人獣共通感染症の重要性を証明するものとして、過去 35 年間にまとめられたデータは、多剤併用の抗ウイルス薬治療にもかかわらず、世界中で約 7,800 万人が感染し、約 3,500 万人が死亡していることを示しています3。

三量体 gp160 HIV-1 エンベロープ スパイク タンパク質 (Env) は、gp120 と gp41 のそれぞれ 3 つのプロトマーを含む膜貫通糖タンパク質であり、ビリオン上の単一のウイルス由来タンパク質です。 したがって、これは、患者内で自然に発生する、またはワクチン接種によって非感染者から誘発される防御抗体の唯一の標的です4、5、6。 とはいえ、多様なウイルス株に対して必要な広範な抗体、いわゆる広域中和抗体（bnAb）をワクチンで誘導しても、ヒトCD4 T細胞へのウイルスの最初の結合をブロックしたり、その後のEnvの構造変化を阻害したりする抗体を生成することはできていない。結合後のウイルスの宿主細胞への侵入に必要な付随的な融合イベント（参考文献7で概説）。 Env の免疫認識は、その異常な配列可変性 8、密なグリコシル化 9,10、および重要な部位と準安定状態の構造マスキング 11 によって妨げられます。 それにもかかわらず、一部の慢性 HIV-1 感染患者は、長年の感染を経て bnAbs を発症します 4、5、6。 それに伴うウイルスの多様化と広範な抗体の体細胞変異により結合親和性が向上し、パラトープとエピトープ間の一致が最適化されます12。 BnAb は、CD4 結合部位、gp120 上の V1V2 および V3 グリカン部位、gp41-gp120 境界領域、および gp41 膜近位外部領域 (MPER) に対して向けられます 4、5、6。 Env 外部ドメインをその膜貫通 (TM) ドメインに接続する MPER は、分岐群間で最も保存された HIV-1 セグメントの 1 つです 13。 この保存性と、天然に生じる MPER を標的とする bnAb が最も広い中和範囲を示すという観察により、MPER がワクチン設計の重要な標的として指名されました。

MPER 単独の構造、および膜模倣環境における TM ドメインとともに MPER の構造は分光法によって広範囲に研究されており、MPER ペプチドは膜に埋め込まれたねじれたヘリックス - ヒンジ - ヘリックス構造をとり、隣接する柔軟性が追加される傾向があることが証明されています 13 ,14、そして bnAb に結合した MPER が膜から部分的に抽出されることを示唆しています 15。 しかし、MPER ペプチド ワクチンは bnAbs を誘発できず、膜に埋め込まれた Env 三量体全体の一部としての MPER の正確な性質については依然として議論の余地があります。 あるクライオ電子断層撮影（クライオ ET）研究では、MPER が 3 つの分離したヘリックスから構成される三脚状の構造を形成していると報告されています 16 が、他のクライオ ET 研究では、3 つの MPER セグメントがコンパクトなストークに組織化されていることが示されています 17,18。 したがって、合理的なワクチン設計の目的のためには、脂質二重層と Env 三量体の完全なグリコシル化外部ドメインの両方の文脈における MPER の実際の配置を解明するための高解像度の構造が必要です。

今回我々は、哺乳類細胞で発現させたHIV-1 Envタンパク質を脂質ナノディスクに再構成し、単粒子クライオ電子顕微鏡法（クライオEM）を用いて、その構造単独およびbnAb 4E10の最大3つのFabとの複合体の構造を決定した。 粗視化分子動力学 (CGMD) シミュレーションと併用すると、これらの構造は、膜上の Env 外部ドメインと MPER の動力学を明らかにします。 さらに、これらの 4E10 Fab の結合数の増加に伴う隣接脂質および TM ドメインの推定摂動に加えて、MPER の構造変化も確認されています。

BG505クレードA株由来のEnvスパイクタンパク質のgp145 SOSIPコンストラクト19は、細胞外ドメイン全体（残基1〜662）、MPERおよび膜貫通セグメント、細胞質ドメインの17残基（図1a）から構成され、HEK293で発現されました。細胞。 完全長タンパク質と比較して発現がはるかに優れているため、C 末端が短縮された Env コンストラクトが使用されました。 アフィニティークロマトグラフィーにPG9 Fabを使用してドデシルマルトシド（DDM）で精製し、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を行った後（補足図1a、b）、組換えgp145は、次のモル比1.5：1：1.07の混合物でナノディスクに再構成されました。パルミトイル オレイル ホスファチジルコリン (POPC)、パルミトイル オレイル ホスファチジルグリセロール (POPG) および脳極性脂質抽出物。 この脂質混合物は、コレステロールが欠けていることを除いて、HIV-1 膜の組成と類似しています 20。 コレステロールは HIV-1 リピドームの最も豊富な成分ですが、20% コレステロールを含む膜を使用して実行された CGMD シミュレーションでは、細胞外ドメインの動的挙動、特に傾斜角が示され、クライオ EM マップで見られたものと一致しました (下に）。 空のナノディスクは SEC によって除去されました (補足図 1a)。 SECピーク画分のSDS-PAGE分析により、gp145とナノディスクアセンブリに使用された膜足場タンパク質MSP1D1dH5の両方の存在が確認されました（補足図1b）。 DDM でネガティブ染色された gp145 の EM 画像は、gp145 のほとんど 3 回対称の上面図を示しました (補足図 1c)。一方、ナノディスクに埋め込まれた gp145 のネガティブ染色 EM 画像は側面図を示し、ナノディスクを明らかにしました (補足図 1d)。 次いで、ナノディスクに包埋されたgp145をbnAb 4E10のFabフラグメントとインキュベートし、BS3で架橋し、グリッド上でガラス化した。 RELION-3 による画像処理により、選択した粒子の約 80% に 4E10 Fab の明らかな密度がないことがわかりました。 これらの粒子をさらに処理すると、全体の解像度3.9Åでナノディスクに埋め込まれたgp145の密度マップが得られました（図1bおよび補足図2〜4）。 このマップにより、外部ドメイン残基 31 ～ 662 の原子モデルと残基 663 ～ 671 のバックボーン モデルを構築することができました (詳細については「方法」を参照)。 このマップでは膜貫通ヘリックスは解決されず、これはナノディスクに埋め込まれた全長 Env タンパク質の以前のマップでも解決されませんでした 21。これはおそらく、ナノディスクに対するシングルスパン TM ドメインの位置の変動の結果であると考えられます。 ただし、追加の低解像度密度（約5Å、補足図4b）はMPER-Nセグメントの始まりを表しており、そこにMPERのNMR構造のN末端セグメントを配置しました（PDB：2PV6）14（補足図4d）、したがって、膜および三量体Env外部ドメインとの関連におけるMPERの配置が明らかになりました。 各プロトマーのMPER-Nセグメントは、三脚状の立体構造をとる3つの独立したヘリックスを形成します（図1b、c）。これは、MPERが収束する16かコンパクトなストークを形成する以前に報告された構造とは異なります17、18。

gp160 のドメイン アーキテクチャ。 FP、融合ペプチド。 NHR、N末端ヘプタッドリピート。 CHR、C末端ヘプタッドリピート（オレンジ色）。 MPER-N (緑); MPER-C (マゼンタ); TM、膜貫通ドメイン。 CT、細胞質尾部。 上の数字はセグメントの最初の残基を示し、下の数字は最後の残基を示します。 b 左: 低い輪郭レベル (0.011) でのナノディスクに埋め込まれた gp145 のクライオ EM マップ。 ナノディスクの密度は薄黄色で示されています。 右: ナノディスクに埋め込まれた gp145 のより高い輪郭レベル (0.014) のクライオ EM マップを半透明の灰色で示し、リボン表示で示すモデル化された gp145 構造がマップに適合しています。 CHR 領域はオレンジ色で、MPER-N セグメントは緑色で示されています。 外部ドメインの残りの部分は青色で表示されます。 c 左: 膜面に対して平行(上)および垂直(下)から見たgp145の構造。 右: 完全な MPER (PDB: 2PV6) の NMR 構造を gp145 モデルに追加した後の左パネルと同じビュー (MPER-N セグメントのオーバーレイに基づく)。 CHR 領域はオレンジ色、MPER-N セグメントは緑色、MPER-C セグメントはマゼンタで示されています。 d MPER-TM の 2 つの利用可能な NMR 構造のクライオ EM マップへの配置 (MPER-N セグメントの位置に基づいて配置)。 三脚構造 (PDB: 6DLN) はマップ (左) によく適合しますが、茎-気泡構造 (PDB: 6E8W) の MPER-N セグメントは、膜貫通ヘリックスがマップから遠く突き出ているため、クライオ EM マップとあまり一致しません。ナノディスク密度（右）。 e gp145外部ドメインが膜面に対して広範囲の角度をとることを示す、ナノディスクに埋め込まれたgp145の3つのクライオEMマップ。 マップは半透明の表面として示され、外部ドメインの構造は色のついたリボンとして示されています。 外部ドメインの端（残基Ala662）からナノディスクの中心（破線で示す）までの距離を測定した。

我々の構造は、MPER-Nセグメントが脂質二重層に部分的に埋もれていることを示しており（図1b）、MPERが膜に浸したらせんセグメントを形成していることを示した以前のNMR構造と一致しています14。 MPER-N と MPER-C ヘリックス 14 を接続するヒンジと、MPER-C セグメントと TM 領域の信頼できる密度の欠如により、私たちのマップは MPER-C セグメントの位置や構造について情報を提供しません。 TM ヘリックス。 とはいえ、以下で議論するように、各 MPER-C セグメントは Env 三量体の中心に向かって後方に伸びており、各プロトマーの MPER 結合 TM ドメインは緩やかな関連または三量体軸の 3 重軸の近くに近似している可能性があります。 、あるいは、1 つは MPER-TM の 2 つの NMR 構造で観察される TM バンドルに関連しています 22,23。 注目すべきことに、他の研究では、天然の三量体スパイク内のTMヘリックスは剛直な三量体を形成しないが24、ウイルス融合プロセス中にそのような構成に移行する可能性があることが示唆されている。 NMR 構造の 1 つ (PDB: 6E8W)22 では、MPER-C セグメントはそれぞれの TM ドメインとある程度連続したヘリックスを形成していますが、MPER-C ヘリックスは歪んでおり、三重軸から離れて曲がっています。 その後、MPER-C セグメントと MPER-N セグメントの間のヒンジ領域に強いねじれが形成され、その結果、MPER-N セグメントが 3 回軸に近づきます。 これをストーク・バブル構造と呼びます。 もう 1 つの NMR 構造 (PDB: 6DLN)23 では、強いねじれを形成するのは TMD と MPER-C の間のヒンジですが、MPER-C と -N セグメントは 3 重ヘリックスから伸びる連続ヘリックスを形成します。三脚構造を形成します。

完全なEnv三量体との関連でMPERの立体構造を比較するために、隣接するプロトマー間のMPERセグメントのN末端、すなわち残基Lys665のCα原子の間の距離を測定した。 私たちのクライオEM構造では、距離は30Åですが、NMR三脚構造では距離は53Å、NMRストークバブル構造では16Åです（補足図5a）。 この測定により、我々の構造内の MPER セグメントが 2 つの NMR 構造の間の立体配座を採用していることが確認されました。 ただし、3つのMPER-NプロトマーのTrp666残基はストークバブル構造に収束して疎水性コアを形成しますが、これはクライオEM構造の場合には当てはまりません（補足図5b）。 さらに、MPER-N セグメントをアンカー ポイントとして使用して 2 つの NMR 構造をクライオ EM マップに配置すると、NMR トリポッド構造の寸法がマップにはるかによく適合し、この構造が 3 次元構造の MPER 立体構造に近いことが確立されます。 Env タンパク質全体のコンテキスト (図 1d)。 NMR トリポッド構造とクライオ EM 構造の間の MPER 構造における残りの違いは、外部ドメインによって MPER に課せられた制約による可能性が最も高く、これはクライオ EM 研究では存在していましたが、NMR 研究では欠落していました。

ナノディスクに埋め込まれた gp145 のデータ処理により、細胞外ドメインが膜面に対して広範囲の角度をとることができることが明らかになりました。 外部ドメインの傾斜の範囲をよりよく特徴付けるために、反復 3D 分類を実行しました (補足図 3)。その結果、ナノディスクの明確に定義された密度と、原子モデルを明確にドッキングするための外部ドメイン密度の十分な特徴を備えた 20 のマップが得られました (例を に示します)。図1e)。 ドッキングされたモデルから生成されたムービーは、Env 三量体がナノディスク膜に対して受けることができる傾斜の程度を示しています (補足ムービー 1)。 マップは、外部ドメインの 3 回軸が膜法線から少なくとも 30°まで傾く可能性があることを示しています (図 1e および補足ムービー 2)。 傾斜の結果、膜の表面から外部ドメインの距離は20Åも増加します（図1e）。

膜上の細胞外ドメインの動態をより深く理解するために、CGMDシミュレーションを使用しました（図2a）。 HIV-1 膜はコレステロールが豊富であることが知られているため、gp145 は 20% コレステロールを含む POPC 二重層に埋め込まれました 20。 シミュレーションは、細胞外ドメインが非常に可動性があり (補足ムービー 3)、最大約 63°傾く可能性があるというクライオ EM の結果を裏付けました。 5 回の 10 μs シミュレーションから、外部ドメインは平均して 17.6° ± 10.0° 傾いていますが、広範囲の傾きを想定しています (図 2b)。 CGMD シミュレーションでは、MPER が非常に動的であり、時折膜面から離れることも示されています (補足ムービー 3)。しかし、MPER の動きが細胞外ドメインの傾斜と相関しているという兆候はありません。 CGMDスナップショットを原子論的ビューに変換すると、外部ドメインの高い傾斜自体が膜からのMPERの抽出に有利ではないことも示されました（図2c）。

a 粗視化分子動力学 (CGMD) シミュレーションに使用される膜に埋め込まれた gp145 のシステム。 gp145 外部ドメインは灰色、CHR はオレンジ色、MPER-N は緑色、MPER-C はマゼンタで示されています。 脂質二重層は黄色で示されています。 b gp145 外部ドメインによって採用された傾斜角の分布を示すグラフ。5 つの反復すべてからのデータを要約しています。 実線は平均を表し、灰色の帯は標準偏差を示します。 18°の垂直線は、外部ドメインの全体的な平均傾斜です。 c CGMD シミュレーションからの 2 つのスナップショットは、2 つの高度に傾斜した gp145 外部ドメインを示す全原子ビューに変換されました。 外部ドメインの傾きは、脂質に浸されている (上のパネル) か露出している (下のパネル) かの反対側の MPER-C セグメント (矢印) とは相関していないようです。

CGMD の結果は、MPER 特異的 bnAb の gp145 への結合は 2 つの独立した動態、(1) MPER を立体的に Fab にアクセスできるようにする細胞外ドメインの傾斜、および (2) 膜からエピトープを十分に露出させる MPER の動きに依存することを示しました。 Fab バインディングを好みます。 MPER ヒンジおよび C-ヘリックス 25,26 を認識する構造的によく特徴づけられた bnAb 4E10 を使用することで、この概念をテストすることが可能になりました。 ナノディスクに包埋された gp145 を 100 倍モル過剰の 4E10 Fab とインキュベートすると、ガラス化細胞外ドメインの約 20% が少なくとも 1 つの Fab 分子によって結合されました。 ネガティブに染色された粒子の2D分類によって得られた投影平均により、1〜3個のFabがgp145に結合できることが明らかになった（図3a）。 ガラス化したFab結合粒子を広範に処理した後、2つの4E10 Fab (gp145・1Fab)を使用して、1つの4E10 Fab (gp145・1Fab)と複合体を形成したナノディスクに埋め込まれたgp145の密度マップを8.8Åの解像度で生成することができました。解像度 8.2 Å、解像度 3.7 Å の 3 つの 4E10 ファブ (gp145•1Fab) を使用 (図 3b および補足図 2)。 Fab結合領域でわずか約12Åであるマップのうち2つの解像度が限られているにもかかわらず（補足図4b）、追加の密度の特徴により、これらが結合したFabを表すことが明らかになり、4E10 Fab結晶のドッキングが可能になりました構造（PDB：1TZG）25（補足図6）。 注目すべきことに、マップは、MPER特異的4E10 Fabがgp145に結合する2つの異なるモードを明らかにしている。 gp145・1Fab マップは結合モード 1 を示しており、Fab はナノディスクから膜表面とほぼ平行に伸びていますが、細胞外ドメインと同じ方向に膜面からわずかに離れており、Fab の面は細胞膜の面と平行です。膜。 gp145・2Fab マップでは、1 つの 4E10 Fab も結合モード 1 を示しますが、2 番目の Fab はモード 2 で結合しており、Fab は細胞外ドメインの方向と反対の方向に伸び、通常は脂質の領域であるスペースを占有します。二重層。 さらに、Fab の平面は約 90°回転され、膜平面に対してほぼ垂直になります。 最後に、gp145・3Fab マップでは、3 つすべての Fab が結合モード 2 で gp145 に結合しています。3 つすべての Fab が通常は膜によって占められる空間を占有しているため、このマップにはナノディスクを表す密度が示されていません。

4E10 Fabとインキュベートした後のナノディスクに包埋されたgp145の代表的なネガティブ染色EM画像(左)および1〜3個の結合4E10 Fabを有するgp145を示す2Dクラス平均(右)。 スケールバー: 50 nm。 平均の一辺の長さ: 34 nm。 b 1、2、および 3 個の結合 4E10 Fab を含む gp145 の Cryo-EM マップ。 マップは、Chimera の「カラー ゾーン」コマンドを使用して自動的にセグメント化されました。 細胞外ドメインとナノディスクはライトグレーで、Fab 1 ～ 3 はそれぞれ黄色、金色、茶色で色付けされています。 アスタリスクは、精製に使用された PG9 Fab を表す密度を示します。

1つおよび2つの4E10 Fabと複合体を形成したナノディスクに埋め込まれたgp145の中解像度マップを分析するために、MPER-Cペプチド（PDB：1TZG）25と複合体を形成した4E10 Fabをドッキングしました（補足図6）。 4E10 の重鎖 (CDRH3) の長い相補性決定領域 3 は疎水性が高く、4E10 はその CDRH1 および CDRH3 ループを利用して脂質に結合します 26。これは、これらの CDR が脂質二重層との相互作用表面を形成していることを示唆しています。 ナノディスクに埋め込まれたgp145単独の構造では、外部ドメインは膜面に対して垂直に配向しています（図4a）。 ただし、4E10 Fabがgp145に結合できるようにするには、外部ドメインを約25°傾ける必要があります（図4b）。 最近、同様の傾斜角が、VRC42.0121 の Fab と複合体を形成した AMC011 株の全長 Env タンパク質の低温 EM 構造で見られました。 gp145・2Fab構造の細胞外ドメインは、同様の約25°の傾斜角を示しました（図4c）。 また、膜表面から gp145 細胞外ドメインの距離も測定しました。 gp145 単独の場合、Glu662 (C 末端の 7 アミノ酸配列の終わり、CHR) と Trp666 (膜に浸した MPER の始まり) の間の距離は約 10 Å です。 gp145・1Fab 構造では、この距離は約 20 Å まで増加します。 gp145・2Fab 構造では、2 番目の Fab では距離がさらに約 40 Å まで増加します。 Env の原子モデルとその MPER エピトープ (PDB: 4U6G) に結合した 10E8 Fab の複合体を、AMC011 株の Env 細胞外ドメインの公開されているクライオ EM マップにドッキングしたところ、同様の距離約 40 Å であることがわかりました。 ２つの結合した１０Ｅ８ Ｆａｂ（図４ｄ）２１． まとめると、これらの発見は、MPER ターゲティング bnAbs と複合体を形成した Env 細胞外ドメインが傾いて膜から持ち上げられることを示しています。

a gp145 単独のクライオ EM モデル (外部ドメインは灰色、CHR はオレンジ色、MPER-N は緑色) に NMR 構造 (PDB: 2PV6) からの MPER-C セグメントが追加されており、MPER が膜に埋め込まれており、膜表面から細胞外ドメイン (残基 Ala662) までの距離は約 10 Å です。 b 1 つの 4E10 Fab が結合した gp145 のモデル (黄色で色付け)。細胞外ドメインが傾いて膜からの距離が約 20 Å まで増加していること、および MPER-C セグメント (マゼンタ) が露出してほぼ垂直に配向している必要があることを示しています。膜面への結合 (結合モード 1)。 c 2 つの 4E10 Fab が結合した gp145 のモデル (黄色と金色)。外部ドメインが傾いたままであり、2 つの Fab が非常に異なって結合していることを示しています。 1 つの Fab はパネル (b) と同じ結合モード 1 を示しますが、2 番目の Fab は MPER-C セグメントをメンブレンから約 40 Å まで持ち上げ、メンブレンとほぼ平行に伸びます (結合モード 2)。 この Fab は、通常は膜が占めるスペースを占めます。 d 10E8 Fab-MPER エピトープ複合体（PDB：4U6G）の結晶構造を、Env タンパク質に結合した 10E8 Fab のクライオ EM マップにドッキングすることによって生成された、bnAb 10E8 の 2 つの Fab が結合した gp160 のモデル（青色）。 AMC011株（EMDB：21334）。 このモデルは、外部ドメインが傾いていないにもかかわらず、膜表面から約 40 Å 離れていること、および両方の 10E8 Fab が 4E10 結合モード 1 と同様に MPER-C に結合することを示しています。 e 3 つの 4E10 Fab が結合した gp145 の Cryo-EM 構造 (色は色付き)黄色、金色、茶色）を膜面に平行（上）および垂直に見た（下）。 非対称に結合していますが、3 つの Fab はすべて結合モード 2 を示しています。色分けは図 1 および 2 と同じです。 1～3。

4E10 Fab によって結合された MPER-C セグメント (残基 674 ～ 683) は、非結合状態とは実質的に異なる配向をとります。 ナノディスクに埋め込まれたgp145の構造では、MPER-Cセグメントは膜とほぼ平行に走り、部分的に脂質二重層に浸っているはずです（図4a）。 対照的に、gp145・1Fab 複合体のモデルは、結合モード 1 の最初の Fab によって結合された MPER-C セグメントが膜から抽出され、MPER の C 末端は膜表面近くに残りますが、 MPER-C セグメントは膜面に対して約 80°の角度で配向されています (図 4b)。 結合モード 2 で 2 番目の Fab が結合すると、MPER-C セグメントがさらに除去されます。MPER-C セグメントは膜とほぼ平行ですが、40 Å 近い距離にあります (図 4c)。 MPER-C セグメントのこの位置は TM ヘリックスの抽出を必要とするため、その場で起こる可能性は低いですが、Fab 結合が TM ヘリックスにかなりの引っ張り力を及ぼし、膜貫通領域の乱れを引き起こす可能性が高いことを意味します。そしておそらく、ヘリックスが膜からいくらか抽出されることさえあります。 注目すべきことに、結合モード2での2番目のFabの結合で見られるMPER-Cセグメントの劇的な再配向は、2つの結合した10E8 Fabを持つEnv外部ドメインのモデル化された構造では観察されません（図4d）。 この構造では、両方の MPER-C セグメントが、gp145・1Fab および gp145・2Fab 構造の結合モード 1 で結合した 4E10 Fab で観察されるような立体構造をとります。 4E10と10E8の結合構造の違いは、4E1014,27の膜相互作用表面のより高い疎水性と脂質結合、および/または4E10との複合体形成に使用されるgp145の切断されたC末端ドメインに関連している可能性がある。

gp145・3Fab マップの 3.7 Å 分解能により、外部ドメインの原子モデルとサブユニットの 1 つの MPER 全体、および他の 2 つのサブユニットの MPER のバックボーン モデルを構築することができ、MPER がどのように機能するかを明らかにすることができました。前者に接続されています（図4e、補足図4fおよび7a）。 しかし、ナノディスクまたはTMヘリックスの密度は観察されず、3つの4E10 Fabの結合によりナノディスクから三量体が完全に抽出されることが示唆された。 等温滴定熱量測定による、HIV-1 ウイルス模倣リポソーム上の MPER ペプチドへの 4E10 Fab 結合の事前の直接測定により、-25 kcal/mol のエンタルピー変化が明らかになりました 14。 表面プラズモン共鳴によって測定される 1.0 μM Kd という弱い結合定数に関連する発熱プロセスは、重大なエントロピー ペナルティを示唆しています。 現在、ナノディスクの文脈における 4E10 による gp41 TM の抽出に関する直接的なエネルギー測定はありませんが、単一分子原子間力顕微鏡法により、複数回の膜貫通タンパク質であっても力で展開して膜から抽出できることが明らかになりました (pN ）接着分子によって媒介されるものと同等かそれ以下である28。 gp145・3Fab マップ (補足資料でさらに説明) は明らかに人工的な状況を表していますが、これにより 2 つの結論を引き出すことができます。 まず、細胞外ドメインの文脈では、4E10 bnAb によって認識される MPER エピトープは、MPER ペプチドと複合体を形成した 4E10 Fab の結晶構造で観察されるのと同じ立体構造のままです（補足図 7b）26。 第二に、3つの4E10 Fabの結合時のEnv三量体の完全な膜抽出は、4E10結合が膜貫通ドメインに及ぼす張力を示しており、これがgp145・1Fabマップにおけるナノディスクの歪んだ外観を説明する可能性があります（図3b）。

Env ダイナミクスに対する bnAb 結合の影響を理解するために、膜に埋め込まれた gp145 の CGMD シミュレーションを分析し、高度に傾斜した細胞外ドメインのスナップショットを原子モデルに変換しました。 モデルの多くでは、MPER-Cセグメントの立体構造は、4E10 Fab複合体の結晶構造で見られるものとはあまりにも異なっており、明確なドッキングを可能にしていません（補足図8a）。 この発見は、4E10 エピトープが抗体結合に最適な立体構造になるのはまれである可能性があることを示唆しています。 あるいは、またはさらに、以前に示唆されているように、抗体の初期相互作用はそのエピトープの一部とのみであり13、これがMPER-Cセグメント全体のフォールディングを触媒し、Fabとその全体との完全な結合を可能にすることが考えられます。結晶構造に見られるエピトープ25、26。 さらに、ほとんどすべてのモデルで、MPER-Cセグメントは、4E10 FabのドッキングによりFabが部分的に膜に埋め込まれるか、細胞外ドメインと立体的に衝突するような方向に配向されていました（補足図8b）。 しかし、あるスナップショットでは、gp145・1Fab構造に見られるのと同様の配向のMPER-Cセグメントが示されており、その立体構造により4E10 Fabのドッキングが可能でした（図5a）。 膜に埋め込まれたgp145・1Fab複合体のCGMDシミュレーションは、外部ドメインが4E10 Fabの非存在下で見られるのと同様に広い範囲の角度を取ることを示しました（図5bおよび補足ムービー4）が、平均傾斜角は28.7°です。 ± 12.0°、リガンドのない細胞外ドメイン (17.6° ± 10.0°) とは異なります。 さらに、リガンドなし gp145 の 3 つの MPER-C セグメントの平均傾斜は 29.0° ± 20.7° (補足図 9) ですが、互いに独立して動いているように見えます (図 5c および補足図 10)。 10E8 Fab結合gp145の場合、MPER-Cセグメントはより明確な角度を持っています（図5dおよび補足図11）。 Fab結合MPER-Cは、クライオEMマップから得られたものと同様に、64.9°±10.4°の高い傾斜で安定しています（図4b）。一方、隣接するMPERは、中間の傾斜を採用しています。 42.5°±15.3°であり、2番目のFabの結合を促進するのに十分である可能性があり、最後のMPERは、リガンドが結合していないgp145のMPER-Cセグメントの傾斜角と同様に、20.6°±12.7°の低い傾斜角を仮定します。

a 粗視化分子動力学 (CGMD) シミュレーションに使用される、4E10 Fab が結合した膜包埋 gp145 のシステム。 gp145 外部ドメインは灰色、CHR はオレンジ色、MPER-N は緑色、MPER-C はマゼンタで示されています。 結合した Fab は金色で、脂質二重層は黄色で示されています。 b 5つのリピートすべてからのデータを要約した、4E10 Fab結合gp145外部ドメインによって採用された傾斜角の分布を示すグラフ。 実線は平均を表し、灰色の帯は標準偏差を示します。 29°の垂直線は、外部ドメインの全体的な平均傾斜です。 c 非リガンドgp145のCGMDシミュレーションの1つで経時的に採用された膜面に対する3つのMPER-Cセグメントの角度。3つのセグメントの非常に動的で相関のない動きを示しています（すべてのリピートからのデータについては補足図10を参照） 。 d 4E10 Fab結合gp145のCGMDシミュレーションの1つで経時的に採用された3つのMPER-Cセグメントの角度。Fab結合が異なる平均角度で3つのMPER-Cセグメントを安定化することを示しています（すべてのデータについては補足図11を参照）繰り返します）。

ナノディスクに埋め込まれた gp145 単独の構造と、最大 3 つの 4E10 Fab との複合体の構造は、MPER への bnAb 結合の前提条件と結果を明らかにします (図 6a)。 ほとんどの場合、高度にグリコシル化された Env 細胞外ドメインは、bnAb エピトープが膜に大幅に浸漬されている MPER を保護します。 しかし、我々のクライオEMおよびCGMD分析は、細胞外ドメインが膜に対して広範囲の角度を取ることができることを明らかにしました。 約 25° (4E10 Fab 結合 gp145 のクライオ EM マップで見られる角度) 以上の傾斜角では、MPER は最大 24% の確率で発生します (リガンド非結合 gp145 の CMGD シミュレーションから推定)。 Fab結合にアクセスしやすくなりますが、これには独立して、エピトープが膜上に十分に露出し、少なくとも抗体との最初の結合相互作用を可能にする立体構造をとる必要があります。 部分的に露出したMPERと抗体が結合した後、完全に結合するとMPERが膜抽出された構成で安定化し、それによって下流の半融合および融合プロセスを促進するMPERプロトマーの独立した同等の動きが破壊されます（以下を参照）。 他のMPERを標的とするbnAbのエピトープ結合Fabと、それぞれのエピトープによって導かれる4E10 Fabとを重ね合わせると、これがこれらのbnAbの中和活性の一般原理である可能性があることが示唆されます（図6b）。 抗体の結合は、膜貫通ドメインに張力を及ぼすことによって Env 機能にも干渉します。 私たちのマップでは、この張力が TM ドメインに及ぼす影響は明らかにされていませんが、以前の研究では、抗体の結合が TM ドメインによって形成される推定上のらせん束を破壊する可能性があると提案されています 21。 さらに、抗MPER bnAbがリガンドのないEnv構成および受容体結合Env構成およびプレヘアピン中間状態に結合する能力（補足図12）により、ウイルス中和を媒介するための時間枠が延長されます。

gp145 外部ドメインは灰色、CHR はオレンジ色、MPER-N は緑色、MPER-C はマゼンタ、膜貫通ドメインは水色で示されています。 脂質二重層は淡黄色/茶色で示され、抗体は明るい黄色で示されます。 a Env タンパク質の直立配向では、bnAb 4E10 の MPER エピトープ (* で示す) は細胞外ドメインによって閉塞され、bnAb にアクセスできなくなり、ほとんどの場合、露出されずに膜に埋もれています。 外部ドメインの傾斜により、一時的に反対側の MPER がアクセス可能になり、これがエピトープの少なくとも部分的な露出と同時に発生すると、bnAb は最初の相互作用を行うことができます。 抗体が完全に結合すると、膜上の MPER の動きが変化し、膜貫通ドメインに歪みが生じるため、膜融合に必要なさらなる構造変化が防止されます。 b HIV-1 Envに結合したMPER標的bnAbのFabの構造アラインメント。 bnAbs 4E10 (PDB: 4XC3)、DH511 (PDB: 5U3N)、10E8 (PDB: 4U6G)、および PGZL1 (PDB: 6O3J) の Fab がコンセンサス MPER エピトープ (マゼンタ) に基づいてアラインメントされ、すべての MPER-C がターゲティング bnAb は、同様の方法で HIV-1 Env に結合します。 4E10 の脂質相互作用表面は、他の bnAbs26 の表面よりも疎水性が高いことに注意してください。

実験的に観察された HIV-1 三量体外部ドメインの傾斜およびねじり運動は、MD シミュレーションと一致しています。 膜受容体の外部ドメイン、特にシングルパス TM セグメントを持つ外部ドメインの動きは予想できますが、他のシステムで報告された同様の経験的知見は知りません。 膜模倣環境における Env タンパク質の以前のクライオ EM 研究でも、Fab 結合 Env の傾斜が観察されましたが、観察された傾斜は主に Fab 結合の結果であると解釈されました 21。 対照的に、この研究の完了後に発表されたネイティブ HIV-1 ビリオンの最近のクライオ ET 研究でも、Env タンパク質がウイルス膜に対して異なる傾斜角を取ることがわかり 29、したがって、我々の単一粒子クライオ EM および CGMD の結果が独立して裏付けられています。 Env タンパク質は、結合した抗体の非存在下で傾斜運動を行います。 この点に関して、HIV-1 受容体 CD4 とその共受容体 (CXCR4 または CCR5) 30 による gp120 への直交ドッキングの調整が、それぞれ gp160 媒介融合に必要な構造変化を刺激および開始する 31 という課題を引き起こすと考えられる。外部ドメインのジェスチャーによって軽減されます。

そうは言っても、MD シミュレーション中、分析の大部分では三量体がウイルス膜の近くに存在し、三脚を塞いでしまうことを強調する価値があります。 4E10 Fab が結合していないナノディスクに埋め込まれた三量体の 3.9 Å 分解能マップに使用されたのは、蓄積された単一粒子の 10% 未満でした。 当然のことながら、他のものは不均質すぎて MPER 三脚を視覚化できませんでした。この事実は、MPER が膜上で柔軟であるという概念を強調しています。 MPER の大部分が膜に浸されているというこの見解は、本明細書 (図 1) および独立したクライオ ET データ 29 に記載されている 10 Å のクロールスペースを形成する膜への gp160 細胞外ドメインの近接性とも一致しています。 これら 2 つの所見は、MPER が Env 細胞外ドメインとウイルス膜の間に茎状の結合を形成していると思われる、アルドリチオール 2 で不活化されたウイルス粒子上の HIV-1 BaL Env 三量体の別のクライオ ET 研究から推定されたものとは対照的です 32。 この差異の根拠は現時点では不明です。

ウイルスクレードにわたるこれまでのNMR研究では、20,000以上のウイルスHIV-1株の配列分析から同定された、必須のヘリックスキャッピング残基によってロックされたタンデムジョイントを備えた、ヒンジで分離された構造的に保存されたウイルスの脂質に浸したN-ヘリックスとC-ヘリックスのペアが同定された。 これらのキャップのアラニン置換による両方の関節の破壊は、CD4依存性およびCD4非依存性株によって媒介される半融合と融合の両方を無効にしました13。 これらの可動性疎水性 MPER セグメントと同時にウイルス膜を覆うことにより、融合を媒介する溶媒和脂質二重層を物理的に近づけるのに必要なウイルス膜の脱水が少なくなり、必要な高速度バリアが減少します 31,33。 さらに、MPER-TM セグメント自体が、膜の半融合と融合にも関与する膜の湾曲と脂質の移動性を誘導します 33。 インフルエンザ A34 を含む他の複数のウイルスと比較して、HIV-1 ビリオンあたりのスパイク数が桁違いに少ないことを考えると、MPER のこれらの融合促進機能は注目に値します。 単一のFabの結合は、結合したMPERの膜表面の動きだけでなく、他の2つのプロトマーの膜表面の動きにも影響を及ぼし（図5dおよび補足図11）、1つの抗体またはそのFabフラグメントの結合は不活化するのに十分であると思われるためです。三量体 35 であるため、MPER のこの変化は中和に重要に寄与している可能性があります。

HIV-1 融合のすべての段階における MPER の重要な役割を考慮すると、ウイルスがその三脚構造を免疫抗体攻撃から保護する理論的根拠は明らかです。 スパイクティルティング、およびおそらく CD4 プライミングにより、抗体 Fab アームへの一時的なアクセスが可能になりますが、他のウイルス細胞外ドメイン部位の免疫優勢は、MPER ターゲティングを軽減する効果的な陽動戦略です 35,36。 我々の以前のMPER免疫原性研究では、膜表面に配列されたMPERはin vivoで免疫原性があるが37、ワクチン誘発抗体の大部分の進入角は細胞外ドメインによって課される立体ブロックと適合しないことが明らかになった。 将来のワクチン戦略は、ティルティング中にネイティブ MPER に結合するために、抗体のアプローチ角度を既存の bnAb が採用する角度に制限することです (図 6b)。 2 つの RNA ウイルス、つまり HIV-1 と CoV-2 に対するワクチンの有効性の大きな違いは、高い突然変異率と、前者と後者のグリカン遮蔽の密度に関連しています 38。 したがって、本明細書で定義される理論的根拠を考慮すると、HIV-1 の最も高度に保存されアクセスしやすい部位を標的とすることは、HIV-1 に対する防御ワクチンの開発にとって重要であると思われる。

PG9 HRV3C IgG は、FreeStyleTM 293 発現培地を使用して懸濁培養された FreestyleTM 293-F 細胞 (Thermo Fisher Scientific) で発現されました。 FreestyleTM 293-F細胞の1L培養物を、PEI「Max」(Polysciences, Inc)を使用してHC:LC PG9 DNAの2:1(w/​​w)混合物でトランスフェクトした。 6日後、細胞をペレット化し、上清をプロテインA-セファロースカラムにロードしました。 IgG を 0.5 M 酢酸を使用して溶出し、溶液を 3 M Tris-HCl、pH 9.0 で中和し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 8 mM Na2HPO4、および 2 mM KH2PO4、pH 7.4、137 mM NaCl、 2.7 mM KCl)。

4E10 IgG は、ExpiTM 293 発現培地を使用して懸濁培養された ExpiTM 293-F 細胞 (Thermo Fisher Scientific) で発現されました。 ExpiTM 293-F細胞の1L培養物を、PEI「Max」(Polysciences, Inc)を使用してHC:LC 4E10 DNAの1:1(w/​​w)混合物でトランスフェクトした。 4 日後、細胞をペレット化し、上清をプロテイン G-セファロースカラムにロードしました。 ５００ｍＭ酢酸を使用してＩｇＧを溶出し、溶液を３Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和し、ＰＢＳに対して一晩透析した。 4E10 Fab は、4E10 IgG (15 mg/mL) を 100 mM ジチオスレイトール中で 37 °C で 1 時間還元し、続いて 2 mM ヨードアセトアミド中で 4 °C で 48 時間アルキル化することによって調製しました。 次に、IgGを、25 mM Tris-HCl、pH 8.5、および1 mM EDTA中のエンドプロテイナーゼLys-C (0.01 μg/μL; Roche Applied Sciences)で37℃で4時間消化しました。 切断反応を、1 mM Nα-p-トシル-1-リジン クロロメチル ケトン (TLCK) および 0.4 mM ロイペプチンで停止し、切断産物をプロテイン A-セファロースカラムに通して、Fc および無傷の IgG を除去しました。

HIV-1 BG505 株の Env タンパク質の残基 1 ～ 723 をコードする DNA 配列。3 つの安定化変異 (Ala501Cys、Thr605Cys、Ile559Pro)、導入されたグリコシル化部位 (Thr332Asn)、および改良されたフリン切断部位 (REKR から RRRRRR) を含みます。およびフリン遺伝子は、pEG BacMam 発現ベクターに個別にクローン化されました。 プラスミドを大腸菌 DH10Bac 細胞に形質転換し、バクミド DNA を生成しました。 組換えバキュロウイルスは、27℃のSf-900III SFM培地で培養したSpodoptera fragiperda Sf9細胞における3回のウイルス増幅を通じて生成されました。 タンパク質発現のために、gp145 およびフリン DNA をそれぞれ含むバキュロウイルスを 2:1 (v/v) の比率で混合し、FreestyleTM 293-F 細胞に 1:10 (v/v) の比率で感染させるために使用しました。 感染の 24 時間後、酪酸ナトリウムを最終濃度 10 mM で培養物に添加し、培養物を 37 °C から 30 °C に移動し、さらに 48 時間増殖させました。 細胞を回収し、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＰＢＳ中で洗浄した。

gp145 三量体は、公開されているプロトコール 39 に基づいて若干の変更を加えて精製しました。 gp145 を発現する FreestyleTM 293-F 細胞を PG9 IgG とともに少なくとも 3 時間インキュベートし、PBS で洗浄し、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、0.5% Triton X-100 およびプロテアーゼ阻害剤を含む溶解バッファーで可溶化しました。カクテル（ロッシュ）。 細胞溶解物を 38,400 × g、4 °C で 1 時間遠心分離した後、上清をプロテイン A 樹脂 (GenScript) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 樹脂を、１０カラム容量（ＣＶ）の洗浄緩衝液１（５０ｍＭ トリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３ｍｇ／ｍＬデオキシコール酸ナトリウム、０．１％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳ）、１０ＣＶの洗浄緩衝液で連続的に洗浄した。 2 (50 mM Tris-HCl、pH 7.5、500 mM NaCl、0.03 mg/mL デオキシコール酸ナトリウム、0.1% (w/v) n-ドデシル β-D-マルトシド (DDM))、および 10 CV の洗浄バッファー 3 ( 50 mM トリス-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、0.03 mg/mL デオキシコール酸ナトリウム、0.1% DDM、2 mM EDTA)。 プロテイン A 樹脂に結合した PG9 IgG を、80 mM L-システイン (Sigma Aldrich) を補充した洗浄バッファー 3 中で 3 C プロテアーゼを用いて 4 ℃ で 4 時間かけて Fab に消化しました。 溶出液を、ＳＥＣ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３ｍｇ／ｍＬデオキシコール酸ナトリウム、０．０５％ ＤＤＭ）による５ＣＶの洗浄とともに収集した。 タンパク質溶液を、Amicon Ultra 15 mL 100 kDa カットオフ遠心フィルター (Millipore Sigma) を使用して濃縮し、SEC バッファーを使用して Superose 6 サイズ排除カラム (GE Healthcare) に通しました。

この研究で使用した脂質は、脳極性脂質抽出物、パルミトイル オレイル ホスファチジルコリン (POPC) およびパルミトイル オレイル ホスファチジルグリセロール (POPG) であり、すべて Avanti Polar Lipids から購入しました。 脂質を、超音波処理しながら３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の２０ｍＭ コール酸ナトリウムで可溶化し、１．０７：１．５：１のモル比で混合した。 ナノディスクに再構成するために、DDM で精製した gp145、足場タンパク質 MSP1D1dH5、および脂質溶液を 1:20:300 のモル比で混合しました。 氷上で 30 分間インキュベートした後、Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad) をサンプル容量の 30% まで添加して界面活性剤を除去しました。 3 時間後にバイオビーズを交換しました。 混合物を一定回転させながら 4 °C で一晩インキュベートした後、バイオビーズを重力によって沈降させ、ナノディスクに埋め込まれた gp145 を含む上清を収集しました。

ナノディスクに埋め込まれた gp145 を 4E10 Fab と 1:100 のモル比で少なくとも 3 時間インキュベートしました。 Amicon Ultra 15 mL 50 kDa カットオフ遠心フィルター (Millipore Sigma) を使用してサンプルを濃縮し、50 mM HEPES、pH 7.4、および 150 mM NaCl で平衡化した Superose 6 サイズ排除カラムにロードしました。 4E10 Fabで装飾されたナノディスクに埋め込まれたgp145を含むピーク画分をプールした。

サンプルの均一性は、記載されているように、0.7% (w/v) ギ酸ウラニルを使用したネガティブ染色 EM によって最初に評価されました 40。 ネガティブ染色 EM 平均を計算するために、100 kV の加速電圧で動作する Philips CM10 電子顕微鏡 (Philips) 上の XR16L-ActiveVu 電荷結合素子カメラ (AMT) を使用して、各サンプルについて 100 枚の画像を収集しました。 校正された倍率は ×41,513 (公称倍率 ×52,000) で、標本レベルでのピクセル サイズは 2.65 Å となりました。 デフォーカスは –1.5 µm に設定されました。 EMAN2 ソフトウェア パッケージ 41 の e2boxer.py コマンドを使用して、各サンプルに対して約 10,000 個の粒子を手動で選択し、180 × 180 ピクセルの画像にウィンドウ表示しました。 画像の正規化と粒子のセンタリングの後、SPIDER42 に実装されている K-means 分類手順を使用して粒子画像を 100 のグループに分類しました。

ナノディスクに埋め込まれた gp145-4E10 Fab 複合体を、氷上で 30 分間、モル比 1:600 の BS3 で架橋しました。 架橋は、50 mM Tris、pH 7.5を添加することによって停止させた。 サンプルを、50 mM Tris、pH 7.5、150 mM NaClを含む緩衝液に対して透析して、架橋剤を除去した。 サンプルの均一性はネガティブ染色 EM によって検査されました。 クライオ EM の場合、サンプル濃度は NanoDrop 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific) で測定され、0.2 mg/mL に調整されました。 4°に設定した Vitrobot Mark VI (Thermo Fisher Scientific) を使用して、4 μL のアリコートを穏やかに発光放電させた酸化グラフェン (GO) グリッド (Quantifoil R1.2/1.3、Cu、400 メッシュ、電子顕微鏡サイエンス上の GO) に適用しました。 ℃、湿度100%。 20秒後、グリッドを-2のブロット力で1秒間ブロットし、液体窒素で冷却したエタンに浸しました。 Cryo-EM データセットは、K2 Summit 電子検出器 (Gatan) を備えた 300 kV Titan Krios 電子顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific) を使用し、超解像度計数モードで公称倍率×29,000 で収集されました。 2 × 2 ピクセルにわたってビニングした後、校正されたピクセル サイズは試料レベルで 1.03 Å でした。 10 秒の露光は、線量率 8 e-/ピクセル/秒で 40 フレーム（フレームあたり 0.25 秒）に分割され、総線量は 80 e-/Å2 となりました。 データは、SerialEM43 を「スーパーファースト モード」で使用して収集されました。このモードでは、ステージを次の位置に移動する前にビーム チルトとイメージ シフトを使用して 3 × 3 の穴が露光されます44。 デフォーカス範囲は-1.5μmから-2.5μmに設定した。 データ収集パラメータは補足表 1 にまとめられています。

5 つのデータ収集セッションからの 30,404 個のムービー スタックは、MotionCorr245 でゲイン正規化、動き補正、線量加重が行われ、2 × 2 ピクセルにわたってビニングされました。 コントラスト伝達関数 (CTF) パラメーターは、R​​ELION-347 に実装された CTFFIND4 (参考文献 46) を使用して推定されました。 粒子は、Gautomatch (http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/) を使用してテンプレートなしで自動的に選択され、個々の画像に抽出され、正規化され、RELION-3 で 100 クラスへの 2D 分類が行われました。 良好な 2D 平均を持つクラスが結合され、3,039,896 個の粒子が生成されました。

4E10 Fab が結合した粒子の同定は、gp145 細胞外ドメインの密度が優勢であるため複雑でした。 したがって、明確な側面図を示す 2D クラスの粒子のみが選択され、cryoSPARC v248 の ab initio アルゴリズムを使用して 4 つの初期モデルを生成するために使用されました。 ab initio 再構成により、3 つの 4E10 Fab が結合した外部ドメインの明確な密度を示す 1 つのマップ、外部ドメインのみの強い密度を示す 1 つのマップ、および 2 つの「ジャンク」マップが生成されました。 最初の 2 つのマップとジャンク マップの 1 つを初期モデルとして使用し、cryoSPARC v2 で 2 ラウンドの不均一リファインメントを実行しました。その結果、結合した 3 つの 4E10 Fab について明確な密度を示す 362,646 個の粒子のスタックと、結合した 4E10 Fab のみについて明確な密度を示す 1,878,941 個の粒子のスタックが得られました。外部ドメイン。

3つの結合した4E10 Fabの明確な密度を示す362,646個の粒子は、cryoSPARC v249でその後の均一かつ不均一な精製を受け、3.66Åのグローバル解像度で最終マップが得られました（補足図4a）。

細胞外ドメインのみの明確な密度を示す 1,878,941 個の粒子は、まず、ナノディスクに埋め込まれた全長 HIV-1 のクライオ EM マップからキメラの Segger ツールで生成された 2 つの参照マップを使用して、RELION-3 で教師付き分類を受けました。 PGT151 Fab および 10E8 Fab が結合した AMC011 株由来の Env タンパク質 (EMDB 21332)21。 1 つの参照マップには外部ドメインとナノディスクの密度のみが含まれていましたが、2 番目の参照マップには 10E8 Fab の密度も含まれていました。 この分類によって Fab が結合していると特定された 224,730 個の粒子は、さらなる 3D 分類の対象となりました。 精製に使用された PG9 Fab の密度は常にマスクされていました。 最初の 3D 分類を 8 つのクラスに分類した後、明確な Fab 密度を示した 4 つのクラスを組み合わせて、4 つのクラスに 2 回目の 3D 分類を行いました。 結果として得られたクラスのうち 2 つは、1 つの 4E10 Fab が結合した細胞外ドメインを示しました。 これら 2 つのクラスは結合され、さらに 2 回の 3D 分類を受けて 4 つのクラスに分類されます。 23,538個の粒子を含む最終マップは後処理によって鮮明化され、グローバル解像度8.8Å（gp145・1Fab）の密度マップが得られました（補足図4a）。 4 つのクラスへの最初の 3D 分類のうちの 1 つのクラスは、2 つの 4E10 Fab が結合した細胞外ドメインを示しました。 このクラスには21,454個の粒子が含まれており、マップは後処理によって鮮明化され、グローバル解像度8.2Å（gp145・2Fab）のマップが得られました（補足図4a）。

4E10 Fabの密度が示されていない最初の教師あり分類からの残りの1,654,211個の粒子は、ナノディスク密度ありおよびなしの2つのEnvマップを参照として使用して、さらなる教師あり分類にかけられた。 ナノディスクの密度を示す 1,153,408 個の粒子に対して 5 ラウンドの 3D 分類が行われ、分類の各ステップで外部ドメインとナノディスクの両方について明確な密度を持つクラスが選択され、さらなる分類が行われました。 最後に、MPER 領域で最高の密度を示す 2 つのクラスからの 47,616 個の粒子が結合および精製され、続いて CTF 精製とベイジアン研磨が行われました50。 得られた密度マップは後処理によって鮮明化され、グローバル解像度3.9Åの最終マップが得られました（補足図4a）。

ナノディスク表面上で外部ドメインが取り得る配向の範囲を示すムービーは、実験マップから生成されました。 マップは、4E10 Fab の密度を示さない 1,654,211 個の粒子の連続ラウンドの 3D 分類から選択されました。 マップは、粒子数が 1000 個以下であること (可能な限り多くの異なる配向を特定するため) および明確に定義されたナノディスク密度 (外部ドメインの配向を決定できること) に基づいて選択されました。ナノディスク）（補足図3）。 これらの基準により、Chimera51 でムービーを生成するために使用される 20 のマップが生成されました。

gp145 単独の場合、Env 外部ドメインの結晶構造 (残基 31 ～ 662、PDB: 5I8H)52 と MPER ペプチド N セグメントの NMR 構造 (残基 663 ～ 671、PDB: 2PV6)14 を手動で gp145 にドッキングしました。 Chimera の「マップにフィット」コマンドを使用して密度マップを作成します。 チェーンをマージした後、モデルは Coot53 で手動で調整され、phenix.real_space_refine54 を使用して、幾何学的拘束とラマチャンドラン拘束が全体的に維持された状態で密度に対して調整されました。 定義が不十分な密度領域の側鎖を除去した後の最終モデルには、残基 331 ～ 662 についてはバックボーンと側鎖の情報が含まれ、残基 663 ～ 671 についてはバックボーンの折り畳みのみが含まれます。

gp145・3Fab 複合体の場合、Env エクトドメインの結晶構造 (残基 31 ～ 662、PDB: 5I8H)52、MPER ペプチド N セグメントの NMR 構造 (残基 663 ～ 671、PDB: 2PV6)14、およびMPER-C ペプチドと複合体を形成した 4E10 Fab (残基 672 ～ 684、PDB: 4XC3)26 を、キメラの「マップに適合」コマンドを使用して gp145・3Fab 密度マップに手動でドッキングしました。 チェーンを結合した後、モデルは Coot で手動で調整され、phenix.real_space_refine を使用して幾何学的拘束とラマチャンドラン拘束が全体的に維持された密度に対して調整されました。 定義が不十分な密度領域の側鎖を削除した後の最終モデルには、残基 31 ～ 662 のバックボーンと側鎖の情報が含まれ、残基 663 ～ 684 のバックボーン フォールドのみが含まれます (チェーン B の残基 678 の側鎖を保持することを除く)。および鎖 D の残基 664、671、および 674。

モデルは半分のマップ 1 に対して精製され、その後、精製されたモデルと半分のマップ 1 (作業)、半分のマップ 2 (フリー)、および結合マップの間で FSC 曲線が計算されました (補足図 4c、e)。

リガンドのない gp145 のシミュレーションでは、細胞外ドメインのクライオ EM 構造 (この研究) を、細胞質ドメイン (PDB: 6DLN) の最初の 7 残基を含む MPER 膜貫通ドメインの NMR 構造にリンクすることによってモデルを構築しました。 このタンパク質を、モル比 4:1 の POPC とコレステロールからなる脂質二重層に配置し、insane.py スクリプト 55 を使用して系を 150 mM NaCl に溶媒和しました。

粗粒度シミュレーションは、Martinize2 (https://github.com/marrink-lab/vermouth-martinize) と最新の MARTINI3 力場モデル 56 を使用して設定されました。 四次構造と三次構造は、力定数 500 kJ mol-1 nm-2、上限および下限カットオフ距離それぞれ 0.9 nm および 0.5 nm で弾性ネットワークを CG モデルに適用することによって保持されました 57。 すべてのシミュレーションは GROMACS 2020.6 (参考文献 58、59) で実行され、リープフロッグ アルゴリズム 60 を使用して 20 fs タイムステップでニュートン運動方程式を積分しました。 シミュレーションは、20 ステップごとに更新される近隣探索の Verlet カットオフ スキームを使用して実行されました61。 静電相互作用は、クーロンカットオフ距離 1.1 nm62 で Reaction-Field を使用して計算されました。 速度再スケールサーモスタットを使用して、温度を 310 K63 に維持しました。 平衡シミュレーションと生産シミュレーションのための圧力結合は、それぞれ Berendsen64 と Parrinello-Rahman barostat65 を使用して実行されました。 独自のランダム シードから開始して、それぞれ 4.75 ns の平衡フェーズと 10 μs の生産実行で 5 つのシミュレーションを実行しました。

4E10 Fabと複合体を形成したgp145のシミュレーションでは、4E10 Fab結合gp145のクライオEMモデルと同様のMPER-C立体構造を示す非リガンドgp145のシミュレーションからスナップショットを取得しました。 この粗粒度スナップショットは、backward.py スクリプト 66 と CHARMM-GUI の全原子コンバータ 67 を使用して、全原子ビューに変換されました。 得られた原子モデルを使用して、gp145 細胞外ドメインとの立体衝突を避けるために若干の調整を加えて、Fab 結合 MPER-C ペプチドによって導かれ、4E10 Fab (PDB: 4XC3) の構造をドッキングしました。 このタンパク質を、POPC とコレステロールのモル比 4:1 で構成される脂質二重層に配置し、insane.py スクリプトを使用して系を 150 mM NaCl に溶媒和しました。

粗粒度シミュレーションを、リガンド非結合 gp145 について説明したように設定して実行しました。 弾性ネットワークは、上記と同じパラメータで適用されました。 結合相互作用を維持するために、弾性ネットワーク相互作用も 4E10 Fab と MPER-C セグメントの間に適用されました。 独自のランダム シードから開始して、それぞれ 6.75 ns の平衡フェーズと 1 μs の生産実行で 5 つのシミュレーションを実行しました。

シミュレーション軌跡は、gmx trjconv を使用して中心に配置されました。 gmx ガングルを使用して、gp145 外部ドメインと MPER-C セグメントの角度を測定しました。 軌跡は VMD v.1.9.4a12 (参考文献 68) を使用して視覚化され、グラフは Microsoft Excel を使用して作成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。 クライオ EM マップは、アクセッション コード EMD-25022 (gp145)、EMD-25024 (gp145•1Fab)、EMD-25025 (gp145•2Fab)、および EMD-25045 で電子顕微鏡データ バンク (EMDB) に寄託されています ( gp145•3Fab）。 原子座標は、アクセッション コード 7SC5 (gp145) および PDB-7SD3 (gp145・3Fab) でタンパク質データ バンク (PDB) に寄託されています。 以前に報告された、使用された PDB アクセッション コードは次のとおりです。1TZG (4E10 Fab/MPER)、2PV6 (MPER ペプチド N セグメント、NMR)。 4U6G (10E8 ファブ/MPER); 4XC3 (4E10 Fab/MPER-C ペプチド); 5I8H (環境外部ドメイン); 5U3N (DH511 ファブ/MPER); 6DLN (MPER 三脚); 6E8W (MPER ストーク - バブル); 6O3J (PGZL1 ファブ/MPER)。 以前に報告された使用された EMDB アクセッション コードは次のとおりです: EMDB-21332 (PGT151 Fab および 10E8 Fab が結合された AMC011) および EMDB-21334 (10E8 Fab が結合された AMC011)。

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リファレンスをダウンロードする

クライオ EM データ収集にご協力いただいたロックフェラー大学の Evelyn Gruss Lipper クライオ EM リソース センターの M. Ebrahim、J. Sotiris、および H. Ng に感謝します。 コレステロールの MARTINI3 ベータ トポロジー ファイルを提供してくださった P. Cesar Telles de Souza 博士に感謝します。 この研究は、国立衛生研究所の助成金 P01 AI126901 (ELR、TW) によって支援されました。

Shuang Yang、Giorgos Hiotis などの著者も同様に貢献しました。

分子電子顕微鏡研究室、ロックフェラー大学、ニューヨーク州、米国

シュアン・ヤン、ジョージ・ハイオティス、トーマス・ウォルツ

米国ニューヨーク州ロックフェラー大学、ケミカルバイオロジーの三機関博士課程プログラム

ジョルゴス・ハイオティス

米国マサチューセッツ州ボストン、ダナ・ファーバー癌研究所、腫瘍内科、免疫生物学研究所

ワン・イー、チェン・ジュンジアン、ワン・ジアファイ、キム・ミギョン、エリス・L・ラインヘルツ

米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部医学部

イー・ワン、ジュンジャン・チェン、エリス・L・ラインヘルツ

米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部生物化学および分子薬理学部門

王佳淮

米国マサチューセッツ州ボストンのダナ・ファーバー癌研究所癌生物学部

王佳淮

米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部小児科

王佳淮

米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部皮膚科

キム・ミギョン

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ELRとTWがこの研究を発案した。 SY、GH、MK、ELR、および TW が実験を設計しました。 SY、YW、および JC は抗体 Fab を調製しました。 SY はすべての生化学および構造生物学の実験を実施しました。 GH はすべての分子動力学実験を実施しました。 JHW、MK、ELR、および TW が実験を監督しました。 著者全員が結果を分析しました。 SY、ELR、TW が原稿を書きました。

エリス・L・ラインヘルツまたはトーマス・ヴァルツとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Tyler Reddy と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Yang、S.、Hiotis、G.、Wang、Y. 他。 HIV-1 の動的なスパイクの動きにより、膜に結合した三脚による抗体攻撃に対する脆弱性が生じます。 Nat Commun 13、6393 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-34008-y

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受信日: 2022 年 5 月 9 日

受理日: 2022 年 10 月 6 日

公開日: 2022 年 10 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34008-y

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