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Aug 04, 2023

細胞培養における発現のための環状 DNA の効率的な修飾と調製

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 5、記事番号: 1393 (2022) この記事を引用

6100 アクセス

2 引用

39 オルトメトリック

メトリクスの詳細

DNA プラスミドは、細胞培養実験における RNA とタンパク質の送達と発現に不可欠なツールです。 プラスミドの調製には通常、細菌のクローニング、検証、精製という骨の折れるプロセスが含まれます。 発現プラスミドは設計して委託製造業者に注文することができますが、多数のプラスミドが必要な場合にはコストが法外に高くなる可能性があります。 当社は、トランスフェクションの準備ができた発現エレメントを含む環状 DNA をわずか 3 時間で生成できる効率的な完全合成方法とプロトコルを開発しました。これにより、細菌のクローニング手順が不要になります。 このプロトコールには、最小限の実践時間で直鎖状二本鎖 DNA フラグメントを取得し、この DNA フラグメントを効率的に環状化および精製する方法が記載されています。 原理の証明として、我々は細胞培養に改変プライム編集ガイド RNA (epegRNA) を発現する Circular Vector を適用し、プラスミドによって発現されるガイドと比較して、この方法の性能が同等、さらにはそれを上回ることを実証しました。 この方法は、準備速度が速く、コストが低く、使いやすいため、短い RNA やタンパク質の発現が必要な用途に有用なツールとなります。

細胞培養における一過性発現のための RNA およびタンパク質の調製および送達には、多くの技術が存在します 1。 この研究では、新しく効率的な準備方法を紹介します。 デモンストレーションとして、遺伝子編集アプリケーションのコンテキストでのメソッドの使用について説明します。 ただし、この方法の背後にある原理は一般的なものであるため、この方法は RNA やタンパク質の発現を必要とするさまざまな目的や用途に役立ちます。 遺伝子編集の具体的な実装について説明し、私たちの方法をいくつかの既存の調製技術と比較しますが、この論文の目的は、実験室環境で発現ベクターを調製するための新しいアプローチを提示することであり、より効率的な遺伝子編集方法を紹介することではありません。そのような。

細胞に送達されたときに遺伝子編集を容易にする 3 つの最も一般的なアプローチは次のとおりです：（I）Cas9 およびその他の補足タンパク質をコードする単一または複数のプラスミド 2、および従来の CRISPR/Cas9、塩基編集、プライム編集またはその他の方法に適したガイド RNA の実装 3,4 ,5,6; (II) Cas9 mRNA およびガイド RNA7; (III) ガイド RNA と複合体を形成した Cas9 タンパク質 8。 前述の遺伝子編集構築物からのさまざまな送達方法が現在使用されています。 送達方法の選択は、特定の要件と研究者の好みに依存します。これには、エレクトロポレーション 9、10、リポフェクション 11、直接物理的トランスフェクション 12、ポリマー粒子およびマイクロキャリアへのベクター送達 13、および前述の方法のモダリティが含まれます。

アプローチ (I)、一過性発現のためのプラスミドトランスフェクションを使用した遺伝子編集は、概念的な単純さ、取り扱いの容易さ、およびプラスミドの安定性のため、一般的に使用されます。 ただし、プラスミドの調製は労働集約的で時間のかかるプロセスであり、通常 2 日かかります 2 (補足注 1 の典型的な細菌クローニング手順を参照)。

当社は、トランスフェクションの準備ができた発現エレメントを含む環状 DNA をわずか 3 時間で生成できる効率的な完全合成方法とプロトコルを開発しました。これにより、細菌のクローニング手順が不要になります。 環状化された DNA は、細胞質内でのエキソヌクレアーゼ分解に対して耐性があります 14。 直鎖状 DNA にはそのような安定性が欠けており、これが遺伝子送達に利用する際の大きな障壁となっています。 さらに、私たちの方法は、エキソヌクレアーゼを使用して未反応または誤反応した直鎖状 DNA 断片を消化することにより、この特性の違いを利用し、それによって環状 DNA を精製します。

発現ベクターの長さの実際的な範囲は 450 ～ 950 bp であり、入力された直鎖状二本鎖 DNA (dsDNA) を環状発現ベクターに変換する効率は最大 62% に達します。 この方法は、やや長いフラグメントに対しては効率が低くなりますが、使用することもできます。 簡潔さと一貫性のため、またこの論文での調製手順と最終生成物の説明との混乱を避けるために、この環状 DNA 発現ベクター構築物および方法を大文字の斜体で環状ベクターと呼びます。

このような環状 DNA 構築物が発現ベクターとして機能することを実証するために、我々はこの方法を適用して、人工プライム編集ガイド RNA (epegRNA) を発現するための環状 DNA を作成しました 5,15,16。そして、Chen によって紹介された 3 つのゲノム位置の編集に成功しました。 et al.15 により、同等の編集効率が得られます。

この研究の目標は、細胞培養実験における RNA およびタンパク質の送達および発現のための効率的な単一チューブ調製方法を開発および検証することでした。 プライム編集ガイドの循環化は、「方法」セクションで説明されているプロトコルに従って実行され、図 1 に概略的に示されています。

a DNA フラグメントの両端に相補的なオーバーハングを持つ IIS 型制限酵素認識部位を含む発現エレメント。 b 制限酵素による切断と、得られたオーバーハングのライゲーションにより、環状 DNA 発現エレメントが形成されます。 T5 エキソヌクレアーゼは、環状化されていないすべての DNA を消化するために使用されます。 c 制限酵素切断 (BsaI GGTCTC) によって作成された相補的 4nt オーバーハング (gtac) の概略図。プライム編集 epegRNA コーディングの詳細な例については、補足図 1 を参照してください。プロトコル手順: (d) T4 DNA リガーゼとタイプを使用して dsDNA テンプレートをピペットします。 IIS 制限酵素試薬を使用し、37 ℃で 1 時間 (または必要に応じてそれ以上) のインキュベーションをプログラムし、続いて T4 DNA リガーゼを 65 ℃ で 15 分間熱活性化します。 放置した場合は、プログラム サイクラーを 4 ℃で一時停止するように設定します。 e 等量の T5 エキソヌクレアーゼ試薬を同じチューブに加え、37℃で 1 時間消化します。 f DNA クリーンアップ キットを使用して、反応混合物から環状 DNA 発現コンストラクトを精製します。

反応の相対収率 (図 2a を参照) は式 2 で定義されます。 （1）制限酵素部位およびDNA末端パディングまたはPCRアダプターを除外した場合の、精製後の環状化DNAの量と理論上の最大可能収量の比による（補足図1および方法セクションの詳細説明を参照）。 Chen et al.15 に記載されているように、環状 PEmax epegRNA 発現構築物の典型的な長さは、プロモーターと末端 RNA ループを持つ pegDNA をコードする配列を含めて 450 ～ 500 bp です。 この研究では、HBB 遺伝子の単一ヌクレオチド置換をコードする 452 bp 環状ベクターを選択しました 15。 我々は、収量が入力 dsDNA の長さと環状化 (ライゲーション) ステップの継続時間にどのように依存するかをテストするために、ランダム化された dsDNA 配列で構成されるさまざまなパディング長を持つ dsDNA のセットを設計しました。 このような 100、300、500、880、および 1330 bp の DNA パディングを必要最小限の 452 bp 環状ベクターに追加すると、552、752、952、1332、および 1782 bp の環状ベクターが得られます (補足図 1 を参照)。 さらに、我々は、実装に機能的発現ベクターを含めるには短すぎるが、潜在的に短い構築物の挙動を検証するという観点からは興味深い、短縮された 282 bp の環状構造をテストしました。

a 環状化の 1、2、および 12 時間における、インプット DNA 長さの範囲での相対収量。 ライン ノードは、n = 2 ～ 3 の独立した反応サンプルの平均を表します。 ドットはノードの個々のデータ サンプルを示し、見やすくするために水平方向にオフセットされています。 b ゲル電気泳動の組み合わせ画像。 各サブプロットでは、レーン 1 = 1 時間、レーン 2 = 2 時間、レーン 3 = 12 時間の循環化を行いました。 DNA の量は、サブプロット 282 ～ 952 bp でレーンあたり 300 ng に正規化されました。 バンド数が少ないことによる過負荷を避けるために、1332 および 1782 bp のサブプロットでは DNA 量をレーンあたり 150 ng に正規化しました。 各サブプロットのレーンは、円形ベクトルの長さごとに同じ単一のゲル プレートからのレーンのサブセットであり、画像強調を行わずにレーン数を減らすためにのみトリミングされています。 完全なゲルの写真は補足データで入手できます。 c 自己循環化と繰り返される複数のフラグメントの結合の概略図。

テストされた円形ベクトルの長さと円形化期間に対するプロトコルの相対収率を図 2a に示します。 特に、当社のプライム編集ベクターの長さと一致する環状 DNA 長さの範囲 (450 bp 以上) で収量が最も高かった。 この高収量ピークを除くと、収量は比較的一定のままであり、1000 bp を超える長さでは急速に低下しました。

ゲル電気泳動の結果は、複数のバンドに環状化 DNA のみを含む画像を示します (図 2b を参照)。 予想どおり、単一ユニットの環状化に加えて、いくつかのライゲーションにより、二重、三重、および高次のコンカテマーが生じました。これを図2cに模式的に示します。 この仮説は、個々のバンドを切り出し、精製し、配列決定し、個々のバンドから精製した DNA でゲル電気泳動を再実行することによって確認されました。 すべての場合において、サンガー配列決定により、設計と構築された円形ベクトルの間の完全な一致が確認されました。 環状化の大部分は最初の 1 時間以内に発生し、452 bp のサイズでは 48% を超え、952 bp では 26% に減少しました。そのため、この長さの範囲全体で実用的に有用な方法となっています。 当然のことながら、環状化/ライゲーション期間の増加に伴って収量はさらに増加し​​ましたが、高次の組み合わせの割合もライゲーション期間に応じて増加しました（図2bのゲル画像を参照）。

National Institutes of Health の ImageJ ソフトウェア 17 を使用したゲル電気泳動画像の分析では、DNA 重量によるより高いバンドの表現が環状化期間とともにわずかに増加することが示されました (図 3a を参照)。 これは、バンド 1 (単一環状 DNA、青線) とバンド 3 以上の累積値 (黄色の線) を比較すると特に顕著です。 円形ベクター サイズ 282 bp の場合のみ、単体バンド 1 はバンド 2 よりも小さく、反応出力における重みによるバンド 3 以上のベクター単位の合計値よりも小さくなります。

シングル、ダブル、高次コンカテマーの合計に対応する、1 番目、2 番目、および 3 番目以降のバンドの合計を示します。 線のノードは、ゲル電気泳動バンドの輝度から計算された n = 2 の独立した反応サンプルの平均を表します。 ドットはノードの個々のデータ サンプルを示し、見やすくするために水平方向にオフセットされています。 a 相対 DNA 重みは相対バンドの明るさに等しい。 b 相対バンドのモル数は、バンドの相対輝度をバンド数で割ったものとして計算されます (式 (2) も参照)。

バンド 1 のモル単位数は常に相対的に高くなります。これは、モル表現がバンド DNA 重量をバンド数で割ったものに比例するためです (図 3b を参照)。 長さ 450 ～ 950 bp の環状ベクターでの 1 時間のライゲーション時間では、バンド 1 のモル分率は約 70%、バンド 2 はさらに 20% を占め、高次のバンドを合わせると残りの 10 ～ 15 になります。 %。 ライゲーションの 12 時間後、バンド 1 のシェアは約 6% 低くシフトしますが、バンド 2 はほぼ一定のままで、合計した上位バンドのシェアは約 6% 増加しました。 これは、単一ユニットの円形ベクトルの追加収量があったとしても最小限で、高次バンドの重みが増加することを表します。

逆に、1000 bp を超えると、より高いバンドが結合して 5% モル分率未満になります。 ただし、収率が 5 ～ 8% と低いため、これらの長い円形ベクトルはこの方法では実際には役に立たないと考えられます。 我々は、結合した環状ベクターコンカテマーの収量と画分分布に対する入力 DNA 長のこれらの変化 (450 bp 付近での収量の明らかなスパイクを含む) は、反応混合物の pH によって影響を受ける DNA 長とフォールディング パターンの組み合わせによって引き起こされる可能性が高いと仮説を立てています。イオンの影響と反応温度18．

環状ベクトルの数の大部分は単一および二重ユニットで構成されますが、高次のコンカテマーは重量によって不釣り合いに表されます。 トランスフェクションの場合、Cas9 を持つプラスミドとガイド プラスミドのモル比率を計算できることが重要です。 プラスミドのトランスフェクション効率は常に細胞の 100% 未満であり、細胞の種類、プラスミドのサイズ、およびトランスフェクション方法によって異なります。 2 つのプラスミドを同時トランスフェクトする場合の完全な比率を決定するのは手間がかかり 19、同時トランスフェクトされた 2 つのプラスミドのサイズが異なる場合は、慣例的にモル過剰の小さいプラスミドが使用されます (たとえば、Bosch et al.20 を参照)。 私たちのプライム編集検証実験では、環状ベクターは、置換する epegRNA16 を発現するプラスミドより 5 分の 1 小さいのに対し、これらの epegRNA プラスミド 16 自体は、対応する Cas9 発現プラスミドより約 5 倍小さい 15 (さらなる議論を参照)。 したがって、式 (2) を使用して、純粋な単一単位の円形ベクトルの場合と比較した場合に、重量でどれだけ多くの円形ベクトルを使用する必要があるかを示す「モル乗数」を計算します。 図4aのライゲーション1時間および12時間のモル乗数の値は、ライゲーション時間が長くなると、より高いバンド画分の主な増加によりモル比が増加することを意味します。

長さと環状化期間によるモル乗数。 452 bp ～ 952 bp の間では、分布に基づく単純な経験則は、1 時間の環状化後の乗数は 1.5 倍、2 時間以上の環状化の場合は 1.7 倍です。 たとえば、Cas9 プラスミドの長さが 13,000 bp で、単一の環状ベクターの長さが 452 bp の場合、モル比 1:1 のメイン プラスミド 1.0 μg には、1.0 × 452/13,000 = 0.035 μg = 35 ng が必要になります。 1.5 倍すると、1 時間の環状化反応に基づく 1:1 モル比の場合、ベクターは 35 ng ではなく 52 ng になります。 線のノードは、ゲル電気泳動バンドの輝度から計算された n = 2 の独立した反応サンプルの平均を表します。 ドットはノードの個々のデータ サンプルを示し、見やすくするために水平方向にオフセットされています。 b HBB、CDKL5、および PRPN のプライム編集による環状ベクターの検証。

環状ベクターの機能性の検証は、HEK293T 細胞培養における 3 つのゲノム位置 (すなわち、HBB、PRPN、および CDKL5) での一塩基置換のプライム編集によって実行されました。これは、Chen らによって使用され、循環ベクターの効率向上を実証しました 15。彼らのPEmaxメソッド。 我々は、抗生物質の選択を容易にするためにブラストサイジン耐性遺伝子を追加して改変された Addgene プラスミド #17482815,21 と組み合わせて、Nelson et al.16 による研究に基づいたガイド設計をコード化しました。 ゲル電気泳動を使用して、調製した HBB、PRPN、および CDKL5 Circular Vector から最初のバンドを精製し、単一の発現モジュール Circular Vector を取得しました。 また、上記のように、補足図 1 に示すように、U6 プロモーターの前に 500 bp の不活性 DNA パディングを追加した同じ 3 つの発現ユニットのセットを調製しました。遺伝子編集の詳細については、「方法」セクションの「トランスフェクション、処理、および」に記載されています。編集された HEK293T 細胞のシーケンス。 Cas9 プラスミドに対して 8X モル比の Circular Vector を使用すると、4X 比と比較した場合、編集効率に無視できる差が生じることが確認されたため、ここで報告されているすべてのゲノム編集実験を通常の 4X モル過剰で実行しました。

EditR22、23で実行された編集効率分析を表1にまとめ、図4bに示します。 PE4max Cas9 プラスミドに対して 4 倍モル過剰の Circular Vector を使用して、プライム編集のコンポーネントとして使用すると、Circular Vector が epegRNA 発現に機能することは明らかです。 編集効率は、3 つの編集位置のうち 2 つについては Chen らによって報告された PE4max の結果 15 に近く、3 つ目の位置である PRNP 遺伝子座については Chen らの編集効率を大幅に上回っていました。円形のベクトル。 特に、プロトコールによって調製された環状ベクターを使用すると、精製されたシングルバンド環状ベクターよりも編集効率が向上し、単一の環状化ユニットではなく、コンカテマーの一部を含む混合物を使用する利点が検証されました。 追加の 500 bp パディングを備えた円形ベクターは、さらに 1 ～ 4% 高い編集効率を示しました (表 1 の太字でマーク)。

我々は、表 1 で観察された結果につながる 2 つのメカニズムを仮説として立てました: (A) おそらく、非常に短い 452 bp の環状ユニットは、長い環状構造よりもポリメラーゼ III との相互作用効率がわずかに低く 24、長さを 2 倍にすると相互作用がわずかに増加する可能性があります。これは、カラム CV と、追加の 500 bp の不活性 DNA パディングを含む CV+500 パッドの間で観察された効率のわずかな増加を説明する可能性があります。 最大の編集効率が必要な場合は、補足図 1 にあるように、追加の DNA パディングを円形ベクター設計に簡単に組み込むことができます。(B) 列バンド 1 CV と CV の間の編集効率の大幅な増加は、〜によって説明できます。単一の環状化発現ユニットと比較して、環状ベクターのコンカテマー混合物のモル単位あたりの発現ユニット数が 1.5 倍大きい。 さらに、連結された円形ベクトルは自動的に長くなります。 これは、環状化期間の延長により、連結された環状ベクトルの表現が向上し、固定モル過剰での編集効率もわずかに向上する可能性があることも意味します。

要約すると、上記の結果は、当社のプロトコールを使用して調製した 450 ～ 950 bp の環状ベクターが、細胞培養におけるプライム編集における epegRNA 発現ベクターとして使用するための RNA の送達および発現に適していることを実証しました。

ここで紹介する環状化の方法とプロトコルでは、細胞培養における CRISPR、塩基、およびプライム遺伝子編集におけるガイド プラスミドの効率的な代替品として使用できる環状ベクターの調製方法について説明します。 この方法の主な利点は、dsDNA を設計、注文し、商業供給者から受け取った後、ほとんど実践的な時間を費やさずに、転写の準備ができた製品を 3 時間以内に使用できるように準備できることです。 さらに、実践時間の大部分は、基本的なスピンカラムキットの DNA クリーンアップで構成されています。 受け取った DNA の量が少なく、PCR 増幅が必要な場合、必要な量の入力 DNA を増幅するためにプロセスにさらに 1 時間かかる可能性があります。

ここで説明したい主な制限または懸念事項が 2 つあります。

合成反応によって生成されるCircular Vectorの量。 通常、1 回の 50 μl 反応で 2.0 ～ 2.5 μg の生成物が生成されます。 より多くの試薬を使用して反応をスケールアップすることはできますが、大量のベクターが必要な状況では、1 回の最大プレップでミリグラムの生成物を生成する細菌クローニングの能力により、細菌クローニングがより良い選択となります。 ほとんどの場合、各ガイドではわずかな編集のみが行われるため、準備の簡素化と迅速化により、循環化方法が有利になります。

DNA 断片の製造プロセスに固有のエラー率について説明したいと思います。 高い忠実度は、細菌クローニング法の強力なスイートです。 大腸菌によるプラスミドのクローニング時の DNA 複製エラー率は、塩基対あたり 5 ⋅ 10−10 と推定されています 25。 完全なプラスミドを含む大腸菌コロニーが配列決定によって同定され、クローン化されると、予防策が講じられていれば、プラスミドにエラーが含まれる可能性はほとんどなくなります 26。

一方で、商用の DNA フラグメント製造業者が宣伝しているエラー率は非常に高いです。 3 つのメーカーが製造した長さ 800 bp 未満の DNA フラグメントのエラー率は、Twist Bioscience 1/6253 bp、Thermo Fisher Scientific 1/6757 bp、Integrated DNA Technologies 1/6757 bp です。 特に、Twist Bioscience27 と Thermo Fisher Scientific28 はどちらも、Integrated DNA Technologies gBlock の真のエラー率がはるかに高い (それぞれ 1/2705 と 1/1329) と主張しています。

エラー率 1/6253 bp の Twist Bioscience 製造プロセスと、20 bp 長のターゲティング スペーサーを備えた 452 bp の環状ベクターの例を考えてみましょう。 したがって、スペーサーでエラーが発生する確率は、円形ベクトルの場合、約 20 ÷ 6、253 ≈ 1/312 となります。 おそらく、ゲノム内でターゲットが見つからず、この既に小さい 1/312 の潜在的な不一致ガイドのごく一部でオフターゲット編集の試行が行われる可能性があります。 この結論は、gRNA と不適切に結合した遺伝子座の間の複数のミスマッチに対して編集が許容できることを実証した Chavez ら 29 によって支持されています。 264 bp プロモーター領域内でエラーが発生したと仮定すると (補足図 1 を参照)、機能したままになるか、機能しなくなります。 プロモーターが機能しない場合、編集の精度には影響しません。 同様に、エラーが RNA 足場領域に該当する場合、リンカー、エクステンション、またはエンド ループによって epegRNA が機能しなくなる可能性が高く、これも編集の精度には影響しません。 さらに、環状ベクターは通常、Cas9 プラスミドを超えて供給され、機能しない環状ベクターは機能するベクターによってバックアップされます。

したがって、Circular Vectors によってもたらされる追加のエラー率は、プライム編集自体、さらには CRISPR/Cas9 および塩基編集によって生成されるエラー率よりも桁違いに低いと予想されます 3、4、5、15、30。これらの手法のうち、本質的に 4 ～ 15% レベルの的外れや編集ミスが発生します。 編集された 3 つのゲノム位置に対して EditR を使用して実施されたサンガー トレース分析では、目立ったオフターゲット編集は示されませんでした。これは、円形ベクトル法を使用したオフターゲット編集が存在する場合、桁違いに大きいという前述の推論と一致します。編集が成功するよりも頻度が低くなります。

場合によっては、複数の RNA を発現する必要がある場合、ポリシストロニック ガイドを使用してソリューションを実装することができます 31。 U6 プロモーターは、プラスミド上に存在する追加の核局在化配列なしで RNA を発現します 16、32、33。そして、我々の検証実験により、Circular Vector についてこれが確認されました。 他のプロモーターを実装する場合、プラスミドと同様に、設計で核局在化を確実にする必要がある場合があります 34,35。

状況によっては、2 つ以上の RNA を発現させる必要があり、別個のプロモーターが必要な場合や、目的の dsDNA 設計に複数のリピートが存在する場合があります。 たとえば、プライム編集メソッド PE3 または PE5max15 では、追加のニックを作成するために 2 番目の RNA ガイドが必要です。 さらに複雑なシナリオも存在します6,36。 このような場合、複数の要素を 1 つの円形ベクトル内で組み合わせることができます。 ほとんどのメーカーは、長い反復を含む DNA フラグメント (反復プロモーターや pegRNA 足場など) を作成できません。 ただし、dsDNA は個別のフラグメントとして注文でき、線形ライゲーションの簡単な追加ステップを実行すると、後で環状ベクター法によって環状化できる結合線形 dsDNA を調製できます (補足図 2 および補足注 3: dsDNA フラグメントの線形結合を参照) ）。 たとえば、プライム編集 PE3 および PE515 には、2 つの RNA ガイドの転写を可能にする 2 つの U6 プロモーターが必要です。 対応する構築物は通常、Golden Gate または Gibson アセンブリを使用して単一のプラスミド ベクターに挿入され、続いて細菌のクローニングが行われます。 さらに複雑なシナリオでは、組み立てと細菌のクローニングの多くの段階で、約 1 週間の作業と取り扱いが必要になります 36。 原則として、結合ステップでは、中間型IIS制限酵素（つまり、補足図2に示されている例ではBbsI）で切断できるフラグメントの設計と順序付けが必要です。 結合は、「方法」で説明されている 1 時間のステップ 1 反応と、それに続く短い DNA 末端カットオフを廃棄するための DNA クリーンアップにより、数時間で完了できます。 私たちの経験では、このような線形ライゲーションにより、ほぼ 100% の効率で線形 dsDNA を結合できますが、損失は主にスピンカラム キットを使用したクリーンアップによるものです。 この予備ステップに続いて、Circular Vector プロトコルを使用した環状化が行われ、その結果、細菌クローニングの多くの段階よりも何倍も早くプロセス全体が完了します。 さらに、純粋な単一ユニットのCircular Vectorが必要な場合は、ゲル電気泳動によって抽出できます。

この方法のもう 1 つの重要な利点は、コストが低いことです。 「試薬、材料、およびコスト」セクションのコスト計算例は、商業供給業者に注文した直鎖状 dsDNA フラグメントの固定コストが 452 bp の環状ベクターで 32.90 ドルであることを示しています。 この反応の費用はわずか 9.30 ドルです。 PCR 増幅が必要な場合、総額に 4.76 ドルが追加され、サプライヤーから入力 dsDNA フラグメントを再注文する必要がなくなります。 このプロトコルでは 2.0 ～ 2.5 μg の円形ベクターが生成されます。これは、24 ウェル プレートで 10 回を超える編集 (ステップバイステップ プロトコルのセクションで使用した量に基づく)、および 96 ウェルで約 40 回の編集に十分です。皿。 これは、設計からトランスフェクションの準備が整ったプラスミドまでの総コストが通常数倍高い細菌クローニングと比べて有利です（さらに、実際の作業と全体の時間もはるかに長くなります）。 2 つの契約製造業者からの価格設定の例に関する補足 5 に示されているように、既製のプラスミドを注文するのはさらに高価であり、既成の epegRNA を注文するのはさらに高価です。

この研究では、短い RNA やタンパク質の発現を必要とするさまざまなアプリケーションで使用できる環状ベクターを調製するための環状化方法とプロトコルを提示しました。 450 bp の環状ベクター長の場合、入力 DNA を環状ベクターに変換する効率は、1 時間のライゲーションで 48%、12 時間のライゲーションで最大 62% でした。 950 bp 長の場合、この効率は 1 時間のライゲーションで 26%、12 時間のライゲーションで 30% であり、長さ 450 ～ 950 bp の環状ベクターの中間値でした。 反応時間が長くなると、Circular Vector 収率がいくらか向上します。 ただし、1 時間という短いライゲーション ステップには、開始から終了までの処理が 3 時間で迅速かつ効率的に行えるという利点があります。

原理の証明として、我々はepegRNAを発現するCircular Vectorを細胞培養に適用し、Chenらによって報告されたプラスミド送達と比較して、この方法の性能が匹敵し、それを上回ることを実証しました15。 その速度、低コスト、使いやすさにより、この方法は遺伝子編集ツールキットのもう 1 つの貴重なツールとなり、反応の単純さによりこのプロトコルは自動液体処理システムに適しています 37。

単一チューブの 2 段階反応とそれに続く典型的なスピンカラムベースの DNA クリーンアップで構成されるこのメソッドを使用すると、研究者は 3 時間で環状ベクターのバッチを生成できます。 Circular Vector メソッドは、Cas9 やその他のタンパク質や遺伝子をコードする不変の大きなプラスミドと連携して機能する、小さな可変ターゲティング コンポーネントの作成を簡素化します。 この大きなプラスミドは細菌培養物中で大量にクローン化され、市販のマキシプレップの 1 つで抽出され、その後数か月間、場合によっては数年間の実験に使用できます。 特に、各編集ターゲットの可変コンポーネント (Circular Vector) を簡単に作成できるようになりました。

環状化された DNA は、細胞質内でのエキソヌクレアーゼ分解に対して耐性があります 14。 直鎖状 DNA にはそのような安定性が欠けており、これが遺伝子送達に利用する際の大きな障壁となっています。 さらに、私たちの方法は、T5 エキソヌクレアーゼを使用して未反応または誤反応した線状 DNA フラグメントを消化することにより、この特性の違いを利用し、それによって環状ベクター DNA を精製します。

CRISPR ガイド発現ベクターの環状化方法では、研究者の好みのツール (SnapGene 6.0.7 を使用) を使用して作成できる最初の DNA 配列設計が必要で、その後、商用メーカーに dsDNA フラグメントを注文します。

事前に作成された dsDNA には、少なくともプロモーター (この例では U6) と、それに続くターミネーター 38 を持つ epegRNA をコードする DNA セグメントが含まれている必要があります (図 1a および補足図 1 の詳細なマップを参照)。 epegRNA は、この目的に適した公開されているツールを使用して設計できます 15、16、39。 2 つの一致するタイプ IIS 制限酵素認識部位により、dsDNA フラグメントの両端近くに相補的な 4 nt オーバーハングが作成されます。 円形ベクトルは、サンガーシーケンスを使用して簡単に検証できます (図 1b を参照)。 2 つのプライマー、Sanger-1 と Sanger-2 を環状構造の反対側の位置近くに配置することは効率的で信頼性が高いことが証明されており、FASTA 配列の中央付近にある反対側のプライマーを含むオーバーラップで環状構造の大部分をカバーします。 プラスミド全体のシーケンスを行うことが望ましい場合、そのようなシーケンスを実行する企業、たとえば Plasmidsaurus (www.plasmidsaurus.com) では、最低 2000 bp のサークルが必要ですが、Octant40 によって開発されたもののようなローリング サークル増幅に基づく技術では、配列短い環状dsDNA。

制限酵素切断によって作成される一致するオーバーハングは、高忠実度のライゲーションを提供するように設計されています 41。これは、典型的なゴールデン ゲート アセンブリに存在する他のオーバーハングが存在しないことによっても促進されます (図 1c を参照)。 図 1c の「nnnnnn」配列は、制限酵素のバックエンドに必要な最小 6 塩基対を表します。 一部のメーカー (Twist Bioscience など) は、適切に設計された PCR 増幅プライマーとして機能し、同時に末端配列を組み込む必要性を排除する末端アダプターを使用して DNA フラグメントを提供することを好みます。

私たちは、Circular Vector の作成方法をユーザーフレンドリーかつ迅速にすることを目指しました。 したがって、我々は主に市販のキットに基づいた反応酵素と緩衝液を使用し、追加の試薬はほんの少しだけでした。 必要に応じて、キットを個々の試薬に置き換えることができます。 十分な量の dsDNA を商業製造業者から受け取った場合は、それを反応に直接使用できます。 それ以外の場合は、所望の量を得るために PCR によって増幅する必要がある場合があります。 環状 DNA ベクターの調製プロトコールは 3 つのステップで構成されます。

ステップ 1: ソース DNA の環状化 (図 1d)。 好ましくは氷上で、200 μl PCR チューブまたは表 2 の反応容量の少なくとも 2 倍の別の適切なチューブにピペッティングすることにより、表 2 にリストされている反応試薬を混合します。 ステップ 2 で消化試薬を追加するには、余分な量が必要になります。チューブをサーマルサイクラーに置き、表 2 のサイクラースケジュールに記載されているように反応を実行します。

ステップ 2: 残りのすべての線状 DNA を消化します (図 1e)。 表 3 に示すように T5 エキソヌクレアーゼ反応混合物を調製し、前のステップの反応混合物が入っているチューブに 1:1 の割合で混合します。 たとえば、ステップ 1 で 50 μl の反応を実行した場合、50 μl を追加する必要があります。 表 3 のサイクラー スケジュールに従ってサーマル サイクラーをプログラムして実行します。

ステップ 3: 環状化 DNA のクリーンアップ (図 1f)。 QIAquick PCR Purification Kit などのスピンカラムキット、またはお好みの方法を使用してください。

上記のプロトコル手順は、この方法を実際に適用するには十分です。 手順の詳細な説明とその背後にある理由については、次のセクションをお読みください。

制限酵素消化およびライゲーション反応の後に、15 分間の熱不活化を行ってライゲーション反応を終了させます (図 1D を参照)。 ミスマッチライゲーションを最小限に抑えるために、一定の 37 ℃ の反応温度が選択されました 42,43。 T4 DNA リガーゼは 65 ℃で不活化します。 より高い不活化温度で制限酵素が選択されたため、制限酵素は活性を維持し、次の消化ステップをわずかに助けます。 リガーゼと制限酵素の濃度は、ゴールデン ゲート アセンブリで一般的な濃度よりもわずかに高い濃度でより効果的に機能することが実験的に決定されました。 このより高い濃度は 2 つの目的に役立ちます。迅速な処理が促進され、さらに重要なことに、制限酵素は DNA フラグメントの両端にある遊離オーバーハングを迅速に切断し、それによって同じ DNA フラグメント上のこれらのオーバーハングのセルフライゲーションが可能になり、互いに連結している複数の DNA フラグメントの割合 (結果セクションのさらなる議論を参照)。 入力した直鎖状 dsDNA の濃度は 7.5 ～ 120 ng/μl の範囲でテストされ、区別できない環状化 DNA の収量と組成が得られました。 120 ng/μl の濃度では、50 μl 反応あたり 6.0 μg の DNA が投入されますが、これは取り扱いと試薬コストの観点から最適であると考えられます。 1 時間のライゲーション時間では ATP の添加は任意であり、ATP 濃度を NEB T4 DNA リガーゼバッファーによって提供される 1 mM から 2 mM に増加させると、特にライゲーション時間が長い場合に収率がわずかに向上します。 これは、高濃度のライゲーション DNA による ATP の枯渇、および反応時間が長くなった場合の ATP の不活性化による可能性があります。 2 mM ATP 濃度は、T4 DNA リガーゼ ミックスの最適範囲内に十分あり 44、ATP 試薬は安価です。 epegRNA をコードする配列に BsaI 認識部位が含まれる場合、異なるタイプの IIS 酵素への制限酵素の置換が必要になる場合があります (わずかに異なるシナリオで BbsI を使用する例については、補足図 2 を参照)。

非環状化 DNA の消化 (図 1e)。 このステップでは、等量の T5 DNA エキソヌクレアーゼ試薬をライゲーション反応に添加します。 たとえば、50 μl のエキソヌクレアーゼ反応混合物を 50 μl のライゲーション反応生成物に添加すると、典型的な 200 μl 容量の Eppendorf PCR チューブ サーモサイクラー内で 100 μl の反応混合物という快適なレベルが得られます (より大きなチューブやドライバスなどは、必要に応じて使用されます)。 T5 DNA エキソヌクレアーゼの濃度は、この研究でテストしたすべての入力 DNA 長について、1 時間以内にすべての直鎖状 DNA を完全に消化するのに十分であることが検証されました。 T5 エキソヌクレアーゼのみをライゲーション反応に添加すると、カリウムイオンが存在しないため、消化速度が非常に遅くなることがわかりました。 NEBuffer 4 の役割は、エキソヌクレアーゼ反応を促進するカリウム アニオンを提供することです。 得られた混合物中のカリウム濃度は NEBuffer 4 反応混合物のみの濃度の半分ですが、切断反応の最適濃度に近いままです 45。 T5 エキソヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性とエンドヌクレアーゼ活性の最適なバランスは、反応 pH 7.9 ～ 8.046 です。 これは NEBuffer 4 の pH ですが、ライゲーションバッファーの pH は 7.5 です。 したがって、表 2 (主要記事) に示すように、適切な量のトリス塩基を添加して pH をこの範囲まで上昇させました。 特に、T5 エキソヌクレアーゼ反応混合物の pH を過度に上昇させることは推奨されません。 pH が 8.5 を超えて上昇することをテストしたところ、環状 DNA を含むすべての DNA が完全かつ迅速に消化されました。

環状化 DNA のクリーンアップ。 このステップでは、高品質の DNA クリーンアップ キットを使用して、十分な濃度と純度の環状ベクター DNA を抽出します。 スピンカラムキットを以下のように選択して使用しました。 このような製品は多数入手できるため、キットの選択は研究者の好み次第です。 ただし、収量は異なる場合があります。 私たちは、一貫して高い収量、低レベルの不純物、および正確で一貫した測定を実現するのに十分な高濃度の DNA を提供する、シンプルなスピンカラムベースの抽出キットを選択することを目指しました。 この純度は、細胞培養トランスフェクションにおける Circular Vector の直接使用と、この研究で報告された濃度および収量測定の精度にとって重要でした。 多数のキットが検討され、次に 3 つのキット (Takara Bio NucleoSpin Gel and PCR Cleanup 740609.5047、QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit 2810648、NEB Monarch PCR & DNA) の DNA 抽出効率と低カオトロピック塩汚染についてテストおよび評価が行われました。クリーンアップキット T1030S49。

同じ PCR 製品セットを使用した検証テストに基づき、他の 2 つのキットと比較して入力 DNA から出力 DNA までの回収率が最も優れていることに基づいて QIAquick キットが選択されました (NucleoSpin より 20%、NEB より 30% 優れています)。また、DNA を入力せずにブランク PCR 製品のクリーンアップをテストした場合、捕捉されたカオトロピック塩の量が少ないことが示されました。 さらに、QIAquick キットは最小溶出量として 30 μl を設定していますが、収量とより高い DNA 濃度を適切に妥協して実行し、20 μl 未満の量で溶出する場合に優れた純度を示します。これは、プライム編集検証実験に適していました。 。 QIAquick PCR Purification Kit は、一連の実験全体で観察された収量の約半分の外れ値が 1 つだけであり、非常に信頼性が高く一貫性があることが証明されています。 この外れ値の結果は、スピンカラムの欠陥が原因である可能性があります。 したがって、サンプルは廃棄されました。

QIAquick キットには、DNA 収量を最大化する上で重要であるため、結合バッファーに添加することが推奨されるオプションの pH 指示薬が含まれています。 指示試薬を使用すると、混合物の pH が結合に最適であるかどうかを確認できます。 特に、QIAGEN48 が推奨するように、pH 調整には 3M pH = 5.2 酢酸ナトリウム 10 μl を 1 回以上添加する必要があると判断しました。

ピペッティングの損失を最小限に抑えるために特別な注意が払われました。 入力 DNA の量は、出力産物 DNA が 2 ～ 4 μg の範囲になるように調整され、測定およびテストに十分な量の最終 DNA 産物が得られました。 極端な場合には、1782 bp Circular Vector のインプット dsDNA の量を 27 μg までスケールアップする必要がありましたが、それでも収量はわずか 1.3 ～ 1.7 μg でしたが、450 サンプルでは 6 ～ 9 μg のインプット DNA 量で十分でした。 –950 bp の範囲。 このような収量の低さは、十分な生成物を生成するために高い DNA インプットと大量の試薬の使用を必要とし、長い環状ベクターの合成が非現実的であることを示しています。 我々は、好ましくは、260/230 および 260/280 比に基づいて高純度 DNA が得られる、80 ng/μl をはるかに超える出力 DNA 濃度を達成することを目指しました。 これは、精製キットを使用するときに追加の洗浄ステップを実行することによってさらに促進され、収量の潜在的な犠牲を最小限に抑えながら一貫して純粋な DNA 出力をもたらしました。 DNA 濃度測定は主に NanoDrop Eight 分光光度計 (ThermoFisher Scientific) で実行され、DS-11 シリーズ分光光度計/蛍光光度計 (DeNovix) で繰り返されました。 注目すべきことに、測定された濃度はこれら 2 つのデバイス間でほぼ一致していました。

重複のない純粋な単一環状ベクターの遺伝子編集性能をテストするためのバンド 1 の抽出は、1% E-Gel EX アガロース ゲル (Invitrogen) での電気泳動による DNA 分離によって実行されました。 Circular Vector DNA は、Monarch DNA Gel Extraction Kit (T1020S) を使用して洗浄ステップを 1 回追加して洗浄しました。

環状化反応の最大可能収量比は、入力 dsDNA 長に基づいた制限酵素切断部位によって決定される環状 DNA 長を割ることによって計算されます。 通常、IIS 型制限酵素は効率的に切断するために、制限酵素と dsDNA 鎖の末端の間に 6 塩基対以上を必要とします。 制限酵素認識部位自体、認識部位と切断位置間のオフセット、およびオーバーハングの長さの 1 つも破棄されます。 私たちの取り扱いには、Twist Bioscience エンドアダプターを保持しておくと便利でした。これは長さ 22 bp で、これらの DNA フラグメントの PCR 増幅に Twist Bioscience プライマーとともに使用できます。 この場合、可能な最大収量比の分母は、Twist Bioscience から注文した dsDNA の長さに 44 bp を加えたものになります。 すべての要素は、次の方程式で正式に説明できます。

ここで、R は最大収量比、Lc は環状化 DNA の長さ、Lenz_site は認識酵素部位、Lenz_offset は酵素認識部位とカットの始まりの間のオフセット、Lcut_length はカットの長さ (通常は 4) bp)、Lend_pad はパディング アダプターまたはエンド アダプター (この場合のように) のいずれかであり、両端の長さが等しいと仮定します。 一例として、452 bp 環状ベクターを作成するためのアダプターを備えた Twist Bioscience によって配信された dsDNA の場合、可能な最大収量比は 0.88 です。 したがって、6 μg の DNA がインプットとして使用される場合、可能な最大収量は 6 * 0.88 = 5.28 μg になります。

環状化反応生成物のモル乗数を、単一の環状ガイドの相対モル分率に対する環化によって生成される合計相対重量の比として定義します。 NIHのImageJを使用して処理されたゲル電気泳動画像から相対的なバンドの明るさを評価します（未修飾のゲル電気泳動画像の完全なセットについては補足図3を参照）。 相対輝度がわかっているので、すべてのバンドの相対輝度を合計する必要があります。これは、定義により、= 1 を各バンドの相対輝度の合計 (Ii) で割って、そのバンドの番号 i で割った値となります。 したがって、モル乗数 M は次のように計算されます。

HEK293T 細胞を、10% FBS を添加した DMEM 中の 24 ウェル プレート (Corning) に 1 ウェルあたり 140 ⋅ 103 細胞で播種しました。 播種から約 24 時間後、メーカーのプロトコールに従って、Optimem (Thermo Fisher Scientific) 中の 2.0 mL のリポフェクタミン 2000 および 800 ng の Cas9 プライムエディター プラスミドをモル比 4:1 (110各ロケーションガイド (15 に基づく HBB、CDKL5 および PRNP の単一塩基置換) について、精製シングルバンド 452 bp 円形ベクターの場合は ng、452 bp 円形ベクターの場合は 175 ng、952 bp 円形ベクターの場合は 370 ng)。

次に、トランスフェクションの 14 ～ 16 時間後、培地を新鮮な DMEM と 10% FBS および 6 ng/μl のブラストサイジン (Thermo Fisher Scientific) で置き換え、プライムエディターを含む細胞を選択しました。 24 時間後に 6 ng/μl を加えました。 次に、24 時間後に培地交換を実行しました (Xiong et al.50 の推奨に基づく)。 72 時間後に、Zymo Research Quick-DNA Microprep Kit (D3020) を使用してゲノム DNA を抽出しました。

Q5 High-Fidelity 2× Master Mix (New England BioLabs) を使用し、マスター ミックス プロトコルを使用して 24 ～ 26 サイクルで 4 ng の全ゲノム DNA から目的のゲノム領域を増幅しました (プライマーのリストについては、Data Availability データ ファイルを参照してください)。 。 続いて、1% E-Gel EX アガロースゲル (Invitrogen) での電気泳動による DNA 分離と、追加の洗浄ステップを 1 回行った Monarch DNA ゲル抽出キット (T1020S) の使用を行いました。 サンガー配列決定は、当社の PCR プライマーを使用して Azenta Genewiz によって実行されました。

ここでは、プロトコールの試薬コストが低いことを、典型的な 50 μl 反応の内訳によって例示しています。 試薬は表 2 および表 3 に記載されている量で使用されます。製造業者の供給元と識別子は表 4 に示されています。Circular Vector に固有の費用の大部分は、商業供給業者に注文した直鎖状 dsDNA の費用です。 452 bp 環状ベクターの例のコストを示します。 私たちが試薬に対して支払った価格は、大学の小売り購入者にとって一般的なもので、追加の割引はありませんでした。 環状化された長さが 452 bp の 470 bp dsDNA フラグメントは、定価 1 塩基あたり 0.07 ドルで Twist Bioscience に注文され、入力 DNA コストは 32.90 ドルとなりました。

通常、1.5 ～ 2.0 μg の dsDNA フラグメントが Twist Bioscience によって提供されました。 50 μl プロトコールの試薬のコストは、ステップバイステップ プロトコールのセクションに記載されている量で補足表 1 に示されています。 計画されている生産量は 2.0 ～ 2.5 μg の Circular Vector で、これには 6.0 μg の dsDNA の投入が必要です。 このような収量は、24 ウェル プレートでは 10 回を超える編集、96 ウェル プレートでは約 40 回の編集に十分です。 このCircular Vectorプロトコルのコストは9.30ドルです。 サプライヤーが十分な量の DNA フラグメントを納品できる場合、費用はすべてお客様の負担となります。

私たちの研究では、PCR 増幅ステップ (オプション、価格は補足表 1 に記載) を実行する必要があり、コストが 4.76 ドル追加されました。 少量のCircular Vectorのみが必要な場合は、反応をスケールダウンして利用可能なDNAの量を減らすことができ、試薬の使用量が減り、結果としてコストが削減されます。

すべてのプロトコル反応は、示されているように、独立した反応 2 回 (n = 2) または 3 回 (n = 3) で実行され、収率の値は平均されました。 上記のサンプルのゲル電気泳動は、国立衛生研究所の ImageJ ソフトウェア 17 を使用して独立したサンプルの複製 (n = 2) で分析され、結果として得られたコンカテマーのパーセンテージ値が平均されました。

編集効率分析は、独立したサンプルからの EditR22、23 を使用したサンガー シークエンシングから 3 連 (n = 3) または 4 連 (n = 4) で実行されました。 EditR によって計算された編集効率の P 値は、すべてのサンプルで P < 5 ⋅ 10−8 でした。 編集効率の値は平均され、対応する標準偏差の値が表 1 に示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

ソースデータは、この論文の補足データ 1 に提供されています。サンガー配列データは、OP971846 で始まり OP971880 で終わるアクセッション番号で GenBank データベースに保管されています。 トリミングされていないゲル画像を補足図3に示します。

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米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部遺伝学科

ローマン・テオ・オリニク & ジョージ・M・チャーチ

オークランド大学コンピューターサイエンス学部、オークランド、ニュージーランド

ロマン・テオ・オリニク

米国マサチューセッツ州ボストンのハーバード大学生物学的インスピレーション工学研究所ウィス研究所

ジョージ M. チャーチ

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RO は研究を設計し、実行しました。 RO と GC はデータを分析し、論文を執筆しました。

ローマのテオ・オリニクへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Valentin Zulkower と他の匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Cesar de la Fuente と Eve Rogers。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

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受信日: 2022 年 8 月 15 日

受理日: 2022 年 12 月 9 日

公開日: 2022 年 12 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04363-z

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