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Jan 07, 2024

細菌ウイルスゲノムゲートキーパーのCryoEM構造と構築機構

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 7283 (2022) この記事を引用

1798 アクセス

1 引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

多くのウイルスは、ポータル ゲートキーパーを介して dsDNA ゲノムをあらかじめ形成されたカプシドにパッケージングしますが、ゲートキーパーはその後閉じられます。 我々は、単粒子クライオ電子顕微鏡法によって得られた、DNAパッケージング後の状態におけるバクテリオファージSPP1（gp612gp1512gp166）のDNAゲートキーパー複合体の構造を2.7Åの分解能で報告する。 天然のSPP1複合体と個々の構成要素のアセンブリナイーブ構造との比較により、そのアセンブリにつながる構造変化の複雑なプログラムが明らかになった。 DNA パッケージング後、gp15 はその C 末端を介して gp6 オリゴマーに結合し、オリゴマー化のために gp15 サブユニットを配置します。 Gp15は、その内側のループを再折り畳みして、6つのgp16サブユニットとの異なるタイプの接触を確立するサブユニット間βバレルを形成する。 Gp16 の結合とオリゴマー化には、ウイルスゲノムをキャプシド内に保つために門脈チャネルを閉じるヘリックスの折り畳みが伴います。 この集合機構は、原核生物尾ウイルス - ヘルペスウイルス系統のウイルスの機能的および進化的意味に広範な影響を及ぼします。

多くの二本鎖 DNA (dsDNA) ウイルスは、正二十面体キャプシドの 5 重頂点の 1 つに特殊なポータル複合体を持ち、そこを通って dsDNA がビリオンに出入りします。 尾部原核生物ウイルスおよびヘルペスウイルスは、DNA パッケージングに先立って、プロカプシドと呼ばれるウイルス カプシド前駆体を形成します。 プロカプシドには、ターミナーゼのドッキングプラットフォームとして機能するポータルタンパク質複合体が組み込まれています1、2、3、4、5。 ポータルとターミナーゼの複合体は、dsDNA をプロカプシドに移行させるウイルス ゲノム パッケージング モーターを構成します。 密に詰まった DNA (>400 mg/mL) は、キャプシドに約 60 atm に達する圧力を加えます6,7。 モーターからのターミナーゼの解離に続いて、パックされたウイルスゲノムの漏洩を防ぐために門脈頂点が閉じられます3。 ポータルチャネルの封鎖は、頭部完成タンパク質を結合して尾部原核生物ウイルスのコネクターと呼ばれる複合体を組み立てることによって達成されます。この複合体は、DNA 輸送用のチャネルを作り出す環状オリゴマーの積み重ねから構成されています 3,8,9,10。 閉じたコネクターを開くことは、尾管への DNA の侵入と、その後の感染開始時の宿主細胞への DNA の送達に必要です。

CryoEM および X 線構造は、多数のポータルタンパク質 5、8、11、12、13、14、P22 ポータルとアダプタータンパク質の複合体 15、およびこのプロセスに関与するいくつかの単離されたタンパク質について報告されています 3、16、17 、18、19。 CryoEM 研究により、DNA パッケージング 10 後、および尾部がポータル頂点に結合するときに組み立てられるポータル複合体に関するより多くの構造情報が得られました 8、20、21、22、23。 それにもかかわらず、ウイルス後のゲノムパッケージング状態における DNA ゲートキーパーの構築の背後にある分子機構はまだ不明です。

バクテリオファージ SPP1 では、gp15 および gp16 ヘッド完了タンパク質が、DNA パッケージング後に 12 量体ポータルタンパク質 gp6 に連続的に結合します9、10、19。 gp15アダプタータンパク質は、gp16ストッパータンパク質と結合することによって後で固定される門脈トンネルを拡張します。 今回我々は、DNAパッケージング後の状態にある902 kDaのバクテリオファージSPP1コネクターのcryoEM構造を2.7Åの分解能で報告する。 コネクターは、不一致の位置でコネクターを囲むキャプシドタンパク質サブユニットを避けるために、テールレス DNA で満たされたキャプシドから抽出されました。 この戦略により、画像処理をコネクタ複合体の分析に集中させ、高解像度の構造を実現することができました。 cryoEM マップ内の 30 のポリペプチド鎖の de novo トレースにより、コネクター複合体全体 (gp612gp1512gp166) の原子モデルを決定することができました。 コネクタータンパク質の構成要素と溶液中でのアセンブリーナイーブ状態との構造比較から、ウイルス DNA ゲートキーパーのアセンブリー中に関与する立体構造変化とさまざまな種類の相互作用の連続経路が推測されます。 この構造研究は、テールの対称性と一致させるためにコネクタ内で対称性の遷移がどのように起こるのかも明らかにします。

902 kDa の SPP1 コネクター複合体は、破壊されたテールレス DNA で満たされたキャプシドから精製されました9。 コネクタ構造は、2.7 Åの分解能（FSCの0.5閾値で）の単粒子分析cryoEMによって決定されました（図1、方法および補足表1を参照）。 この解像度により、複合体のcryoEMマップ内のgp6、gp15、およびgp16のポリペプチド鎖の明確なde novoトレースが可能になりました（補足図1および2）。 以前の報告10、19、20とは対照的に、コネクターはgp6とgp15の両方の12のサブユニットを含むが、gp16のコピーは6つだけであることを発見しました（図1）。 Gp15 と gp16 は、コネクター内で集合する前は単量体です 24。 DNA パッケージング後、gp15 はポータルに結合し、12 量体の環状オリゴマーを形成します。 この組み立てステップは、gp1620 とは独立して行われます。 コネクター複合体の閉鎖には、gp16 の gp15 への結合が必要であり、ウイルスキャプシド内にファージ DNA を保持する gp16 6 量体 (図 1) の構築が引き起こされます 10,20。 これらの観察と得られたコネクター構造 (図 1) を組み合わせると、コネクターの組み立てには gp6-gp15、gp15-gp15、gp15-gp16、および gp16-gp16 の相互作用イベントが関与していることが明らかになります。

SPP1 コネクタの CryoEM マップ。 各 gp6、gp15、および gp16 オリゴマーの 1 つのサブユニットは、それぞれ青、マゼンタ、緑で示されています。 b コネクタの原子モデル。 明確にするために、オリゴマーの前半分のみを示しています。 gp6 の 4 つのサブユニットは、紫、シアン、青、および紺色で表示されます。 gp15 の 4 つのサブユニットは、オレンジ、赤、マゼンタ、茶色です。 gp16 の 3 つのコピーは緑色のバリエーションです。 サブユニット番号とそのカラーコードが右側に示されており、原稿全体で一貫して使用されています。 c キャプシド側から見た Gp15 十二角形 (左パネル)。 二次構造要素は 1 つのサブユニットに標識されています (右パネル)。 d キャプシド側から見た Gp16 六量体 (左パネル)。 二次構造要素は 1 つのサブユニットに標識されています (右パネル)。

gp6 のポリペプチド鎖は、cryoEM 密度マップで 503 残基のうち残基 28 から 470 まで追跡されました (図 2a)。 コネクター内の全体的な gp6 の折り畳みは、13 mer アセンブリナイーブ型 (PDB 2JES) の gp6 の折り畳みと類似しています 12。 Gp6 には、クラウン、ウィング、ステム、クリップという 4 つの主要なドメインが含まれます (図 2a、b)。 また、門脈中央トンネルの内部に向かって突き出たトンネルループと、ステムドメインの外表面にあるβヘアピンも特徴です（図2a、b）。

a SPP1 コネクターの gp6 サブユニットの二次構造要素。 ドメインは色分けされています: クラウン ドメイン (残基 421 ～ 470) は緑色、ウィング ドメイン (残基 28 ～ 54、88 ～ 255 および 369 ～ 420) はオレンジ色、ヘリックス α6 の傾斜領域を含むトンネル ループ (残基) 347-368) は赤、ステムドメイン (残基 55-62、81-87、256-280 および 327-346) はマゼンタ、gp6 β-ヘアピン (残基 63-80) は青、クリップドメイン (残基) 281–326) シアン。 b コネクターからの gp6 サブユニット (12 量体) と gp6 アセンブリナイーブ 13 量体のサブユニットの重ね合わせ (灰色で表示; PDB 2JES)。 c gp6 13-mer のクリップドメイン。 d コネクタ複合体の gp6 のドメインをクリップします。 gp6、チェーン i-1 の残基 307 ～ 312 は紫色、チェーン i の残基 281 ～ 326 はシアン色、チェーン i + 1 の残基 291 ～ 294 は青色、チェーン i + 2 の残基 64 ～ 76 は紺色で表示されます。 。 クリップは b と同じ方向にあります。 7 Å の距離は、gp6 13-mer の α4 に対するコネクターの α4 のシフトを示します (c を参照)。 e SPP1 DNAパッケージングを損なう変異の局在化。変異グループに応じて色付けされた残基が示されています（補足表2を参照）。 コネクター gp6 サブユニットは、a および b に対して 180° 回転しています。

コネクタ内の gp6 12-mer とアセンブリナイーブ gp6 13-mer12 は、ウイングドメインの内側部分 (残基 29 ～ 54、88 ～ 169、178 ～ 208、および 369 ～ 420、間に RMSD がある) で非常に類似しています。 Cα位置は0.7Å）および門脈幹（残基55〜62、81〜87、256〜280、327〜346、RMSD 0.5Å）（図2b）。 ただし、クラウン領域、トンネルループ、βヘアピン、クリップドメイン内では顕著な構造の違いが見つかりました（図2b）。 トンネルループは、コネクタ内のgp6では短いヘリックスを形成しますが、このヘリックスはgp6 13-mer12には存在しません（図2b）。 コネクタ gp6 のトンネル ループのクライオ電子密度が低いことは、このセグメントがかなり柔軟であることを示唆しています。 コネクター gp6 と gp6 13 mer の最も大きな違いは、2 つのポータル オリゴマーで最も広範なサブユニット間結合を形成するクリップ ドメインに見られます (図 2c、d)。 クリップは、サブユニット i の鎖 β12 と β14、サブユニット i-1 のβ13、およびサブユニット i のヘリックス α4 で構成されるサブユニット間三本鎖 β シートによって形成されます（図 2c、d）。 これらの構造要素は両方の gp6 構造（12 mer と 13 mer）に見られますが、ヘリックス α3 の端の残基 Gln282 とヘリックス α5 の先頭の Pro325 の間で目に見えるシフトが見られます（図 2b-d）。 gp6 13-mer では、ヘリックス α4 は傾斜した配向を持ち 12、その N 末端 Pro296 残基はクリップの底部に局在しています（図 2c、補足図 3a）。 コネクター gp6 では、Pro296 が 7 Å 上方にシフトされ、ヘリックス α4 がサブユニット i + 2 の gp6 β ヘアピンに近い、より水平な配向になります（図 2d）。 コネクターgp6のクリップドメインのこれらの変化は、gp15のC末端がポータルオリゴマーに結合するポケットの形成を引き起こします（補足図3b、c）。 このようなポケットは、アセンブリナイーブgp6 13量体には存在せず（補足図3a）、これがgp1524に結合しない理由を説明しています。

DNA パッケージング後の状態にある gp6 の構造により、SPP1 DNA パッケージング プロセスを損なうことが以前に示されている変異の影響を合理化することができます 25,26。 これらの変異した gp6 タンパク質はプロカプシドに組み込まれているため、これは、それらが正しく折りたたまれ、他のプロカプシド構成要素と相互作用して、適切なプロカプシドの構築が保証されることを意味します 25。 DNAパッケージングに重要な残基25、26は、ポータル構造のさまざまな構造要素に位置しています（図2e）。

ポータルウィングにマッピングされたいくつかの変異（図2e、オレンジ色）は、明らかにこのドメインの局所的な不安定化を引き起こします（補足表2）。 構造に対するそれらの影響が、ポータル中央トンネルを通る DNA パッケージングをどのように破壊するかを解釈するのは困難です。

DNA パッケージングをブロックする一連の変異が gp6 クラウンで見つかりました。 この領域は、DNA がキャプシド内部に移動するトンネル チャネルの上部を形成します。 クラウンの構造組織に影響を与える変異には、サブユニット間結合に関与する残基（Ser428、Ile437、Phe449）が関与し、および/またはヘリックスα7およびα8によって形成されるクラウンの疎水性コア（Ile437Val、Ala443Thr、Phe449Leu）が不安定化します（図2e、緑色）。補足表 2)。

変異残基の別のクラスターは、gp6 トンネル ループ構造 (Ser350、Glu352)、またはα5 (Val347、Lys373) および門脈クラウン (Gly360) とのループ相互作用に影響を与えます。 これらは、DNAパッケージングプロセスにおけるループの役割を強調しています（図2e、赤色、補足表2）。 我々は以前、Glu352Gly の置換がターミナーゼ ATPase 活性の低下につながることを示しました 27。 DNA 転座中のトンネルループとターミナーゼ間のこのクロストークは、おそらくヘリックス α5 と gp6 クリップ領域を介して媒介されると考えられます 28。

DNAパッケージングは​​、ヘリックスα5とクリップの間のヒンジ位置に位置するPro325（図2e、紫色）の変異によっても破壊されます。 gp6 13 mer と gp6 コネクター 12 mer のポリペプチド鎖はこの時点で構造を変化させ、2 つの構造におけるクリップの位置が異なります（図 2b-e）。 置換 Pro325Leu はサブユニット間の結合を破壊し、ヘリックス α5 の長さを延長し、クリップ要素の正しい位置に影響を与える可能性があります。

次に重要な一連の変異は、翼と茎の近くで gp6 β ヘアピンを固定するループで見つかります (図 2b、青)。 我々は、このヘアピンの変異によりクリップドメインに対する位置が変化し（図2d、青色のβ1-β2）、クリップポケットの形成が妨げられるのではないかと仮説を立てる。 DNAパッケージングにおけるクリップポケットの本質的な役割は、ループβ12-α4のAsn290、Gly293、およびGlu29425のアミノ酸置換の非常に有害な影響によって明らかになります（図2e、シアン色、補足表2）。 これらの3つの残基はポータルの外側に露出しています（図2e）。 Asn290はループβ12-α4の先端に位置し、その側鎖はそれぞれAsp314のカルボニルおよびGly313の窒素とサブユニット内およびサブユニット間水素結合に関与しています（補足図4）。 これらの相互作用はベータ相互作用を模倣しており、クリップ ドメイン内でループ β12-α4 および β13-β14 を正しく配置するために不可欠です。 Asn290 を置換すると、一方または両方の水素結合が破壊され、これらのループが不安定になります。 Gly293 と Glu294 は側鎖接触を行わず、これらの置換の表現型がターミナーゼとの直接相互作用の欠陥に起因することを示唆しています 29。 パッケージングモーターの分解時にこの相互作用が中断されると、gp6 クリップポケットが gp15 結合の準備が整います。 ターミナーゼとクリップの同じgp6領域とのgp15の逐次相互作用は、変異Glu294LysがSPP1 DNAパッケージングを破壊するのに対し、同じ残基Glu294Glyの置換はその後のgp1526への結合のアセンブリステップのみを損なうことを発見することによって裏付けられる（補足表2を参照。以下を参照） ）。 この構造機能解析を総合すると、ファージ DNA パッケージングに不可欠な要素として、ポータル チャネルとクリップを裏打ちする構造要素が強調表示されます。

DNA パッケージングの終了に続いて、ターミナーゼが離脱し、gp15 が gp6 に結合し、コネクターの組み立てが開始されます。 gp15のコアは4つのヘリックスで構成されています（図1c、右パネル）。 その C 末端は gp6 を向いており、ヘアピン β1-β2 は gp16 を向いています。 gp15は、主にgp6クリップポケットへのC末端の挿入を介してgp6オリゴマーと相互作用します（図3a、b、補足図3c）。 鎖 j + 1 の gp15 C 末端は、gp6 鎖 i のクリップと 9 つの鎖間結合を確立します (補足表 3)。 鎖 j + 1 の gp15 His37 も gp6 鎖 i+1 のクリップ残基 Asp292 と結合します (図 3b)。一方、gp15 Arg102 は gp6 鎖 i+2 の β ヘアピンからの Asp68 のカルボニルと水素結合を確立します (図 3b; 補足表 3)。 この相互作用ネットワークは、gp15 Met100との水素結合を破壊するgp6のGlu294Gly変異（図3b）、またはgp15の5つのC末端残基（ArgLysMetAlaArg）のMetAlaGlyによる置換が、gp15のgp620への安定した結合を妨げる理由を説明している26。 これらの相互作用は、gp15 C末端とgp6ポケットの間の静電ポテンシャル相補性とそれらの形状一致によって特徴付けられます（補足図5a）。

gp6-gp15インターフェイス。 gp15 サブユニット j + 1 (マゼンタ) の C 末端は、図に示すように、シアン (i)、青 (i + 1)、および紺 (i + 2) で示される 3 つの gp6 サブユニットによって形成されるクリップ ポケットと相互作用します。 1b. コネクタを外側から見た図。 b aの輪郭を描いた領域のgp6-gp15相互作用を拡大して表示。 gp6 サブユニットと gp15 サブユニット間の鎖間水素結合と塩橋は、黒色の破線で表示されます。 c アセンブリナイーブ gp15 モノマー (左) (PDB 2KBZ) と、α ヘリックス コア (マゼンタ) を介して重ねられたコネクター内の gp15 サブユニット (中央) の比較。 ヘリックスα0は緑色、ループα2-α3は青色、C末端はオレンジ色で示されている。 コネクターからの gp15 サブユニットと NMR モノマー (灰色) のオーバーレイを右パネルに示します。 緑色の矢印は、ヘリックス α0 の約 145°の回転を示します。 gp15 NMR モノマー (Nm および Cm) およびコネクター内の gp15 サブユニット (Nc および Cc) の N 末端および C 末端は、オーバーレイで標識されています。 d コネクタの外側から見た、gp15 α0 と隣接するサブユニットのヘリックス α1 とのサブユニット間相互作用。 e コネクタートンネルから見た Gp15 Glu85 サブユニット間結合。 f β バレルの外面から見た図は、gp15 β バレルの底部リムと gp16 の間の界面接触を示しています。 破線は、1 つの gp16 サブユニットと 3 つの gp15 サブユニット間の水素結合と塩橋を示します。 g gp15とgp16のN末端間の相互作用を示すβバレルの側面図。

アセンブリーナイーブ gp15 (PDB 2KBZ) は、NMR 構造によって示されるように、α ヘリックスコア、柔軟なループ α1-α2、ヘリックス α2 と α3 の間の大きな非構造化ループ、および柔軟な C 末端で構成される溶液中のモノマーです 19。 αヘリックスコアα1-α3は、コネクター内でのgp15の組み立て後もその立体構造を維持しますが、α0、ループα2-α3、およびC末端は大きな立体構造変化を受けます（図3c、それぞれ緑色、青色、オレンジ色）。 。 gp15のC末端はgp6と相互作用します（図3a、b、補足図3c）。 N末端とα0は145°回転して、ヘリックスα1およびα2との接触を確立します（図3c、右パネルの緑色の矢印）。 サブユニット j のヘリックス α0 は、サブユニット j-1 の α1 の Glu23 と塩橋を形成する残基 Arg5 および Arg8 を介して隣接するサブユニットとも結合します (図 3d)。 最も劇的な構造変化は、ループα2-α3をβ1-β2ヘアピンに折り畳むことによって起こり、gp15の24本鎖分子間βバレルを形成する（図1b、c、および3c）。

コネクター内の単一の gp15 サブユニットと gp6 の間の相互作用の表面積はわずか約 700 Ų であり、EBI-PISA30 によって評価された解離エネルギーの計算値は -1.6 kcal/mol です (補足表 4)。 これは、単一の gp15 モノマーが gp6 リングに強く結合しないことを示しています 31。 対照的に、隣接する gp15 サブユニットの相互作用表面は約 1250 Ų、解離エネルギーは -13.3 kcal/mol です (補足表 4)。 さらに、各 gp15 サブユニットは、コネクター構築中にその環状 12 量体が形成されるため、2 つの隣接する gp15 サブユニットとの界面を確立します。 したがって、gp15 モノマーの gp6 への最初の結合の後に、gp15 サブユニット間相互作用が続き、gp15 と gp6 オリゴマーの安定した会合が保証されます。

gp15-gp15 界面は、サブユニット j-1 のヘリックス α1 と隣接するサブユニット j のヘリックス α0 および α2 の間の横方向の接触を構成します (補足表 3)。 さらに、ヘリックスα0は、塩橋と水素結合のネットワークを介して、コネクタ周辺で隣接するサブユニットのヘリックスα1に結合します（図3d）。 隣接するサブユニットのgp15 β1-β2ヘアピンは、ポータルから遠位にサブユニット間24本鎖のβバレルを形成し（図1b、c）、これがgp15の幅34Åの中央トンネルの輪郭を描いています（図1c）。 各 gp15 サブユニット内では、β ヘアピンはループ α2-β1 および β2-α3 を介してその α ヘリックス コアに接続されています (図 3c、e)。 サブユニット j のループ β2-α3 にある Glu85 のカルボキシレート基は、サブユニット j + 1 の Ser88 および Thr89 の主鎖および側鎖と 5 つの水素結合を確立し（図 3e）、β バレル鎖の全体的な位置を安定化します。

コネクタの下部は 6 つの gp16 サブユニットで形成されています。 それらのそれぞれは、βバレルコア、トンネルαヘリックスα1、およびコネクタの下に突き出ておそらく尾部と相互作用するβ1-β2ループで構成されています（図1d）。

gp15 12量体とgp16 6量体の間の界面は、静電相補性によっても特徴付けられます（補足図5b）。 gp15-gp16 相互作用のほとんどは、gp15 24 ストランド β バレルの下端に関与します (図 1b および 3f、g)。 各 gp16 サブユニットは 4 つの gp15 サブユニットと接触します (図 3f; 補足表 3)。 注目すべきことに、3つの異なるgp15サブユニットの残基Thr77は、同じgp16サブユニットkと相互作用する(図3f)。 gp15 鎖 j+1 の Thr77 は gp16 Ser91 と水素結合を形成しますが、gp15 鎖 j の Thr77 は gp16 の残基 Tyr61 および Arg98 と水素結合を確立します。 最後に、鎖 j-1 の gp15 の Thr77 は、gp16 Gln39 との 2 つの水素結合に関与しています。 さらに、gp15鎖jのArg73はgp16のGlu95と塩橋を形成します（図3f）。 gp15 の Arg73Glu 変異によるこの相互作用の破壊は、gp16 の gp1520 への安定した結合を妨げることが以前に示されています。 gp16 と gp15 の間の 2 番目のタイプの相互作用は、gp15 β バレルと gp15 鎖 j および j + 1 のループ α2-β1 の間の折り目における鎖 k + 1 の gp16 N 末端の挿入によって起こります (図.3g）。 この相互作用のネットワークにより、コネクタ内で 12 ～ 6 回の対称性の移行が確立されます。 全体として、gp16 の各サブユニットと gp15 オリゴマー間の相互作用は、1040 Ų の表面と -11.3 kcal/mol の解離エネルギーを持ち (補足表 4)、gp15 と gp16 オリゴマー間の強い結合を示しています。

コネクター内の gp16 サブユニットは、溶液中のアセンブリナイーブ gp16 (PDB 2KCA) モノマー (図 4a) と同様に、明確に定義された 8 本鎖の β バレル コア (図 1d) を持っています。 gp16構造内の最も劇的な変化は、トンネルαヘリックスに折り畳まれる柔軟なループβ2'-β3（残基43-51）で起こります（図4a）。 コネクター内の 6 つの gp16 サブユニットの α ヘリックスは、隣接するサブユニット間の 5 つのサブユニット間水素結合によって一緒に保持されています。 Gln43はそのうちの4つを作り、5つ目はTyr47-Glu45の間にあります（図4b）。 トンネルヘリックスは、反対側のgp16 Gln51残基の側鎖の間に直径約12Åの狭窄を門脈チャネルに形成します（図1d）。 これは、DNA 二重らせんの直径 20 Å よりも狭いコネクタ トンネルの唯一の領域であり、キャプシド形成後に DNA をキャプシド内に閉じ込めます。 gp16 サブユニット間の相互作用は、隣接するサブユニット間の表面が 510 Ų であり、計算された解離エネルギーが -2 kcal/mol (補足表 4) であるため、gp15 サブユニットへの結合が gp16 六量体を保持するのに重要な役割を果たしていることを示唆しています。コネクタ。 gp16のN末端（残基12〜30）はループβ1-β2を形成し、コネクタの下に突き出ており、おそらく尾部と相互作用します（図1d）。 gp16 への尾部の結合は、感染性尾部ファージにおけるその構造をさらに安定化させる可能性があります 20。

a アセンブリーナイーブ gp16 モノマー (左パネル、PDB 2KCA) とコネクター内の gp16 の 1 つのサブユニット (中央パネル) の NMR 構造の比較。 N 末端は濃青色 (残基 1 ～ 7) で示され、ループ β2' ～ β3 は赤色 (残基 40 ～ 56) で示されます。 右パネルは、βシートコアを介して整列した2つのgp16構造のオーバーレイを示しています。 NMR 構造は灰色で表示されます。 b キャプシド側から見た、gp16 六量体の 2 つの隣接するサブユニットのトンネルヘリックス。 黒い破線は水素結合を示します。 6 回対称軸の位置は黒い六量体で示されています。

今回報告された SPP1 gp612gp1512gp166 複合体の分解能 2.7 Å の構造は、尾部原核生物ウイルスの完全なウイルス DNA ゲートキーパーの詳細な分子構造を明らかにします。 組み立てられていない構成要素の構造と比較すると、広範な機能的および進化的意味を持つゲートキーパーの組み立てにつながる分子イベントが明らかになります（図5）。

a gp6 クリップ内の gp15 モノマーの固定。 gp15 モノマー NMR 構造の 20 個のモデル 19 を重ね合わせて、組み立て前の安定かつ柔軟な構造要素を強調表示します (左パネル)。 N 末端 α0 とループ α2 ～ α3 (それぞれ緑色と青色で表示) は、組み立て中に構造変化を受けます。 a-c 隣接する gp15 サブユニットの gp6 への結合は、gp15 ループ α2-α3 間の衝突を引き起こし、β1-β2 ヘアピンの変化と折り畳みを誘導し（a の曲がった青い矢印は、オリゴマー化時に b で起こる変化を示します）、gp15 サブユニット間 β を構築します。 -たる。 オリゴマー化中にヘリックスα0が再配置され（aの曲がった緑の矢印はbで起こっている変化を示す）、隣接するサブユニットのヘリックスα1を架橋する。 図の下部の尾部側からの図は、明確にするために gp15 サブユニットのみを示しています。 d gp16 の gp15 リングへの結合。 gp16 モノマー NMR 構造 19 の 20 個のモデルを重ね合わせて左側のパネルに示します。 組み立て中に立体構造が変化する gp16 の N 末端とループ β2' ～ β3 は、それぞれ濃青色と赤色で表示されます。 eh コネクター内での gp16 のオリゴマー化後のヘリックス間相互作用によって安定化されたトンネルヘリックスへの gp16 ループ β2'-β3 の折り畳み。 ファージ尾部側からの図を示す。

コネクタ構造は、DNA パッケージング後の状態におけるポータル タンパク質 gp6 の立体構造を示しています。 プロセスを終了させるエンドヌクレオチド切断の前に DNA パッケージングを停止する変異の位置 25,26 により、gp6 の構造要素内の機能的に重要な残基のクラスターが特定されます (図 2e)。 2つのクラスターが王冠と門のトンネルに並ぶループで見つかりました。 他の変異は、ターミナーゼの結合にさらされたクリップポケットを構築する構造要素に影響を与えます（図2eおよび補足図3b）。 ステムヘリックスα5の運動がDNAパッケージング28とgp6構造における変異の局在化に必要であるという以前の発見は、トンネルループがDNAパッケージング中にターミナーゼと協調モードで作用することを示唆している27,29。 ヘリックスα5を介したそれらのクロストークは、主にターミナーゼポンプ活動29によって駆動されるDNA転座と、キャプシド内でDNAが高濃度に達したときにファージキャプシドからDNAが滑り出すのを防ぐためにトンネルループが作用するラチェット機構をサポートしている可能性がある。 以前に提案されたトンネルループのラチェット機能 8,32,33 は、DNA パッケージングのモーター活動と調整されていると考えられます。 ゲノムパッケージング中に機能するこの保持メカニズムは一時的なものです。 DNA をキャプシド内に保持するには、ターミナーゼ離脱時に gp15 と gp16 が門脈系に結合する必要があります 10。 このプロセスは、ターミナーゼとgp15と、gp6クリップのポケット内の共通の結合界面との逐次相互作用によって調整されます（図2eおよび3a、b）。

SPP1アセンブリナイーブgp15およびgp1619のNMR構造とそれらのコネクター内の立体構造との比較は、DNAゲートキーパーのアセンブリ中に起こる構造再配置を強調する(図3c、4a、および5)。 gp15 および gp16 の構造相同体の分析 (補足図 6-8) により、それらの立体構造の理解がさらに広がります。 Gp15 様タンパク質は、保存されたαヘリックスコアを持っていますが、ループα0-α1、ループα2-α3、および/またはC末端の立体構造が異なります。 これらの変化は、単量体から十二量体状態への経路上の構造変化について情報を与えます（補足図6）。 SPP1 gp15 の C 末端は、ポータルタンパク質に結合している場合にのみ定義された立体構造を持ちます。 これは、gp15様アダプタータンパク質をポータルクリップに固定する役割を裏付けています（図5a）。 コネクタの組み立て中、gp15ヘリックスα0はその位置をより水平方向に変化させます（図3cおよび5a、b）。 興味深いことに、gp15ホモログYqbG34ヘリックスα0の組み立てられていないモノマーでは、gp15コネクター状態で見られる配向に近い、鎖内結合によって安定化された位置をとります（補足図6b）。 SPP1では、このような立体構造には、隣接するサブユニットのヘリックスα1を架橋するα0のサブユニット間結合が必要です（図3d）。 変異体 gp15 Arg5Glu Arg8Glu におけるこれらの相互作用の破壊（図 3d）​​により、ファージキャプシドにおける gp15-g16 複合体の形成が可能になりますが、コネクタートンネルの閉鎖は妨げられます 20。 したがって、α0の再位置決めは必須の組み立てステップです（図5のステップaからb、補足ムービー1）。

gp15 および YqbG モノマー 19,34 の NMR 構造は両方とも、高度に可動性のループ α2-α3 を示しています（補足図 6b）。 それらのαヘリックスコアは同様のサブユニット内相互作用を持っています。 シホファージ HK97 のホモログ gp6 タンパク質は、アセンブリナイーブ条件で 13 量体リングを形成し 18、HK97gp618 のループ α2-α3 は逆平行な β 様の鎖間相互作用を持っています（補足図 6b および 7a）。 このループは、コネクタ内で折り畳まれてβシートを構築するSPP1 gp15のループα2-α3と同様の位置に位置しています（補足図6bおよび7b）。 HK97 の gp6 は、ファージ粒子内で集合する際に 12 量体を形成する可能性が最も高いですが 18、13 量体構造は、そのオリゴマー化が隣接するサブユニットの α2-α3 ループ間の β 様相互作用の形成につながることを示唆しています。 我々は、これらが、SPP1 gp15 で見られたような、HK97 のサブユニット間 β バレルの前駆体状態を表すと仮説を立てます。 gp15 NMR モノマーを SPP1 コネクタに剛体フィッティングすると、隣接するサブユニットのループ α2 ～ α3 間の複数の衝突が明らかになり、それらのフォールドの構造変化が決まります。 これらの変化により、gp15 のオリゴマー化中に β バレルが形成されると考えられます (図 5 の a ～ c​​、補足ムービー 1)。 まとめると、SPP1 gp15 相同タンパク質構造を解析すると、gp15 が機能的に組み立てられた状態を達成するために必要なさまざまな立体構造が明らかになります。

gp15 βバレルは、gp16がSPP1ポータル複合体に結合するためのプラットフォームを作成します（図5d）。 gp16 に代表されるコネクタ ストッパーは、共通の β バレル コア 3 によって特徴付けられます (補足図 8)。 ファージλ gpFII17 (PDB 1K0H) のモノマーおよびプロファージ PBSX (PDB 3F3B) の XkdH は、SPP1 gp16 モノマー β2'-β3 ループと同等の柔軟なループを持っています。 このループは、推定上のストッパーSF1141のモノマー内でαヘリックスに折り畳まれています（補足図8b）。 SPP1 gp16 のループ β2'-β3 は、gp16 サブユニットが SPP1 の gp15 リングに結合した後、α ヘリックスにも折り畳まれます (図 5 のステップ f から h、補足ムービー 1)。 5つのヘリックス間接触は、ポータルチャネルを閉塞するヘリックス構造を安定化させますが（図4b）、その後のチャネル開口に必要なこの結合の破壊に対する強力な障壁を課しません。 弱い gp16 サブユニット間結合 (補足表 4) は、gp15 との相互作用が、コネクター内の 6 つの gp16 サブユニットの承認された位置決めに主要な役割を果たしていることを示しています。 これは、特に gp1620 による門脈の閉鎖を損なう gp15 の変異を裏付けています (上記参照)。 gp15-gp16 複合体内の 12 から 6 回の対称性の転移により、コネクターと、6 回の回転対称性を有するファージの予め組み立てられたロングテールの構造との直接の一致が可能になります。

ポータル頂点複合体は、原核生物尾ウイルス - ヘルペスウイルス系統のすべてのウイルス間で保存されている重要な DNA トラフィック ゲートを表します 35。 門脈タンパク質成分は系統内に保存されています。 対照的に、DNAパッケージング後に作用するエフェクターは、ウイルスが異なる細胞宿主に感染するように進化するにつれて分岐しました（図6）。 真核生物のヘルペスウイルスは、門脈系を閉じるキャップに向かって突出する「触手」αヘリックスを備えた門脈タンパク質クリップを備えています4,36（図6）。 クリップドメインは、SPP1 gp6 と同様、尾部バクテリオファージのポータルタンパク質で最も保存された構造要素の 1 つです 3,14。 これらのウイルスは、ポータル DNA トンネルを拡張する十二量体を形成する gp15 様タンパク質も持っています。 しかし、SPP1 gp15 の β バレル領域は、短い尾部を持つファージの相同タンパク質では大きく変化しています (図 6)。 ファージP68およびφ29は、ショートテールDNA導管を形成する100Åより長いβバレルを有する23,37（補足図7c、d）が、T78およびおそらくP2215には、SPP1 gp15 βバレルに相当するものがありません（図6）。 この進化的分岐は、ファージΦ29テールノブタンパク質gp923からのドメインを除いて、短い尾部を有するファージにgp16相同タンパク質が存在しないことによってさらに特徴付けられる（補足図8）。 対照的に、gp16 様タンパク質は長い尾部を持つファージ間で保存されています 38。 gp15-gp16界面の分子構造は、コネクターからテールへの対称性転移を達成し、コネクタートンネルを形成するgp15構造とgp1639の尾管状の折り畳みとを一致させる。 このβバレル折り目は、ロングテールチューブのいくつかのコンポーネントに共通の特徴です 39,40。 gp16 様タンパク質は 3 つの主要な機能を確立するために進化しました。1 つは gp15 様タンパク質との相互作用、2 つ目はウイルス DNA の一時的な保持システムの構築、3 つ目は尾管で尾部と頭をつなぐタンパク質に結合することです。終了3、20、21、41、42。 コネクター多タンパク質複合体の高分解能により、タンパク質成分間の相互作用に関与する最も重要な残基、異なる対称性間の遷移がどのように起こるか、どのタンパク質成分が細胞のメインチャネルを介した DNA 転移の調節に関与しているかを明らかにすることができます。システム。

ポータルタンパク質 (灰青色) は、その系統のすべてのウイルスで保存されています。 原核生物ウイルスのポータルクリップに結合するアダプタータンパク質（明るいマゼンタ）は、ポータルから遠位の領域にさまざまな構造的特徴を持っています。 彼らは、ファージ T7 と Φ29 に代表される短い尾部をもつウイルスと、長い尾部をもつファージとの 2 つの進化的分岐点を定義しています。 長い尾を持つファージのアダプタータンパク質は、ストッパータンパク質 (緑色) を結合するための β バレル (マゼンタ) を囲んでいます。 ヘルペスウイルスのポータルへのターレットドメイン (青色) の追加とアダプタータンパク質の欠失は、ヘルペスウイルスが原核生物ウイルスから分岐していることを示しています。 ヘルペス サイトメガロ ウイルス (HCMV) 門脈タンパク質のドメインと系統進化の軌跡のブレークポイントを定義する尾部ファージ アダプターのドメインを、それぞれ濃い青とマゼンタで示します。 提示された構造は、SPP1 コネクター (gp612gp1512gp166; 本研究では PDB 7Z4W)、HCMV pUL10412 (PDB 7ETM)、T7 gp812gp1112 (PDB 6R21)、および φ29 gp1012gp1112 (PDB 6QZF) です。 ネガティブ染色 (2% 酢酸ウラニル) でのヘルペス ウイルス カプシドと成熟ファージ粒子の代表的な画像が、対応するコネクターの近くに表示されます。 スケールバーは50nmに相当します。

コネクターの構造とその組み立てメカニズムは、尾をもつ原核生物ウイルス - ヘルペスウイルス系統の進化の過程を明らかにします (図 6)。 細菌や古細菌に感染する尾を持った原核生物ウイルスには、ポータル クリップに結合する gp15 様タンパク質が存在します 38,43。 それらの構造は、短い尾部を形成するため、または gp16 様タンパク質を接続するための系統内の分岐点を明らかにします (図 6)。 後者の相互作用は、独立した経路に組み立てられた長い尾部チューブを取り付けるためのインターフェースを作成します。 原核生物は進化において真核生物に先行しました。 したがって、我々は、祖先の原核生物の尾を持つウイルスが、ポータルクリップへのターレットドメインの挿入とアダプタータンパク質との相互作用の喪失によって進化し、真核生物ヘルペスウイルスビリオンのポータル祖先を生み出したと仮説を立てる（図6）。 我々のコネクター構造と比較構造生物学の研究を総合すると、完全なウイルス DNA ゲートキーパーの組み立ての分子機構が明らかになり、ヘルペスウイルスと異なる尾部ファージファミリーの間の進化的分岐経路を追跡するための、長らく待たれていた分子枠組みが提供される。

SPP1 コネクター複合体の精製が報告されました9。 簡単に説明すると、SPP1 尾部のない粒子は、非許容宿主 Bacillus subtilis YB886 にファージ SPP1sus942,44 を感染させることによって生成し、不連続 CsCl 勾配での等密度遠心分離によって精製しました。 無尾粒子を 50 mM EDTA を用いて 55 °C で 30 分間破壊しました。 次に、MgCl2 を最終濃度 100 mM で添加し、遊離 DNA を 37 °C のオーブン内で 50 U ベンゾナーゼで一晩消化しました。 次に、SW41 ローターで 35,000 rpm で実行される、TBT バッファー (100 mM Tris-Cl、pH 7.5、100 mM NaCl、10 mM MgCl2) 中の 10 ～ 30% (w/v) グリセロール グラジエントによる沈降によって、コネクター複合体を精製しました ( Beckman Coulter) 4 °C で 3 時間。 コネクターを含む画分は、SDS-PAGE およびウェスタンブロットにおける gp6、gp15、および gp16 の存在によって同定されました9。 次いでそれらをプールし、続いて濃縮し、カットオフ１００ｋＤａのＶｉｖａｓｐｉｎマイクロ濃縮器で０．５×ＴＢＴに緩衝液交換した。

0.64 mg/mL の精製 gp6gp15gp16 コネクタ複合体の懸濁液 3 μL を、新たにグロー放電した (ising PELCO Easiglow、Ted Pella、米国) C フラット グリッド (Protochips、米国; 2/2 400 メッシュ) に適用し、ブロットしました。 5 秒前にグリッドをプランジ凍結し、Vitrobot Mark IV (ThermoFisherTM) を使用して湿度 96%、4 °C でガラス化します。 データは、試料を液体窒素温度に維​​持し、300 kV で動作する Titan Krios 顕微鏡 (ThermoFisherTM、eBIC ダイヤモンド光源施設、ハーウェル、オックスフォードシャー、英国) で収集されました。 画像は、より高速なデータ取得を可能にする統合モードで Falcon III カメラ (ThermoFisherTM) を使用して記録されました。 データ収集は、EPU ソフトウェア (ThermoFisherTM) を使用して、-1.2 ～ -2.5 μm のデフォーカス範囲内で行われました。 ムービー（ムービーあたり 40 フレーム）は、1 秒の露光にわたって試料面でフレームあたり 1.12 e-/Å2 の線量で収集されました。 校正されたピクセル サイズは、標本レベルで 0.69 Å でした。

3876 個のムービーが MotionCorr246 を使用して位置合わせされました。 CTFFIND447 を使用してデフォーカス値を決定しました (補足図 1)。 顕微鏡写真を手動でスクリーニングしてCTFの品質を評価し、少なくとも4Å以上の高解像度のThonリングの存在に基づいてさらなる処理のために選択しました。 ランダムに選択された 10 枚の顕微鏡写真のセットを使用して粒子を手動で選択しました。 次に、側面図に対応する 5 つの 2D クラスを使用して、データセット全体から自動粒子を選択しました。 Relion 2.048 を使用して、約 520,000 枚の粒子画像が約 3500 枚の顕微鏡写真から抽出されました。 コントラスト伝達関数の補正は、次の処理中に位相反転によって行われました。

処理の最初のステップは Relion 2.0 で行われました。 粒子画像のデータセットには 3 ラウンドの 2D 分類が適用され、氷の汚染、フレーム境界に重なったり付着した粒子を含む異常な画像が除去されました。 主に側面図 (約 10,000 枚の画像) を表す最良のクラスが、最初の位置合わせと再構成のために最初に選択されました。 対称性 C12 を明らかにした、20 Å までローパス フィルター処理したポータル タンパク質 gp6 マップ (EMD-1021)10 を初期モデルとして使用しました。 次に、5 つのクラスを使用して 3D 分類を実行しました。 これらの分析ステップでは対称性は適用されませんでした。 2 つのクラスは明確に定義されておらず、2 つのクラスは明らかな C12 対称性を備えたかなり類似しており、最後のクラスは約 12 回対称の鏡像構造を持っていました。

gp6 13 mer X 線構造 (PDB 2JES)12 の 1 つのサブユニットのメイン ドメインをフィッティングすることによって評価された、正しい利き手を持つ 2 つの構造が平均され、コネクタ複合体の構造を取得するための開始モデルとして使用されました。 520,000 粒子のデータセット全体。 3D 分類と 3D 精製を数回繰り返すことにより、最大 3.5 Å の分解能で構造が得られました。

次の改良ステップでは、位置合わせ後の 2 ～ 21 の映画フレームのサブセットを使用して、高線量の放射線を含むフレームを排除し、粒子画像を再抽出しました。 これらの画像と Relion 2.0 で取得したモデルは、さらに処理するために CryoSPARC49 にエクスポートされました。 CryoSPARC で 3 回の 2D 分類を行った後、次の 2 回の精製のために 401,807 個の粒子画像が選択されました。 対称性 C12 が課された gp6gp15gp16 複合体の構造は、gp16 タンパク質に対応する領域の密度が、gp6 および gp15 の密度と比較してほぼ 2 倍低いことを示しました。 この発見は、コネクタ内のタンパク質成分が異なる対称性を持っていることを示しました。 そこで、対称性を低減して、各タンパク質成分に対応する密度の分布を調べました。 3回対称性を利用すると、gp16の領域に6つのサブユニットがあることが明らかになり、gp16環がC6対称性を有することが示唆された。 この対称性は、複雑な構造の最終改良に使用されました。 3 つのタンパク質のそれぞれに対応する極低温電子密度は、得られた構造において同じ範囲内にありました。

複合体の最終構造は、代表的なフーリエシェル相関 (FSC) によって 0.143 しきい値で推定された分解能 2.4 Å、しきい値 0.5 で 2.7 Å で得られました。 再構成における局所解像度の変動は、ResMap50を使用して推定されました（補足図2d）。

cryoEM マップの解釈は、Chimera51、COOT52、および PHENIX53 を使用して行われました。 gp6 の最初の原子モデル構築は、ステム ドメイン (ヘリックス α3 および α5、gp6 13 量体リングの X 線構造、PDB 2JES12 の残基 256 ～ 280 および 327 ～ 368) の剛体フィッティングによって行われました。 配列の残りのアミノ酸は、COOT を使用してモデルをクライオ EM 密度に合わせて大幅に調整した手動トレースによって新たにフィッティングされました。 このステップに続いて、回転異性体、c-ベータ、およびラマチャンドランの制約を含む、PHENIX の実験マップに対する原子モデルの実空間改良が行われました。 gp6 ウィングの局所的な極低温電子密度が低いため、短い β ストランド β10 (残基 215 ～ 217) は鎖 A、C、E、G、I、および K でのみ見られることに注意してください。 gp15 および gp16 の原子モデルは、cryoEM マップで新たに構築されました。 アミノ酸配列は、COOT を使用して手動で追跡され、PHENIX を使用してクライオ EM 密度マップで実空間リファインメントが行われました。

コネクタ複合体中の各タンパク質の洗練された原子モデルは、COOT での数回の再構築と、PHENIX での回転異性体、c-ベータ、およびラマチャンドラン拘束による実空間洗練によって得られました。 COOT を使用して完全な gp6、gp15、および gp16 ポリペプチド鎖トレースの残基を手動で検査し、回転異性体の配向を修正し、低温電子密度の品質が低い領域 (gp6 残基 170 ～ 176 および 217 ～ 241) をトレースしました。 最終的な原子モデルのタンパク質残基は、よく洗練された幾何学的パラメータを示します。最も好ましい領域、91.71%。 さらに、許可された領域、8.18%。 ラマチャンドラン プロットの外れ値は 0.10% (補足表 1)。 コネクタ複合体におけるサブユニット間結合、相互作用界面、およびサブユニット解離エネルギーは、PISA30 を使用して計算されました (補足表 3 および 4)。 タンパク質界面の静電ポテンシャルは、Pymol54 を使用して計算および表示されました。

構造相同性検索は、コネクターの個々のサブユニット (この研究) と gp15 および gp1619 の NMR 構造を使用して、DALI55 で実行されました。 コネクター (この研究) とアセンブリーナイーブ gp6 (PDB 2JES12) の gp6 ドメイン間のペアワイズ構造比較は、デフォルト設定を使用して DALI サーバー 55 で実行されました。 対応するドメインの PDB 座標が入力として提供されました。 ドメイン内のポリペプチド鎖の Cα 座標を RMSD の計算に使用しました。

図は、Pymol54 および Chimera51 ソフトウェアを使用して作成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。 原子モデルの座標は、アクセッション コード 7Z4W (gp612 - gp1512 - gp166 複合体) でタンパク質 データ バンクに寄託されており、対応する電子顕微鏡密度マップは、アクセッション コード EMD-14509 (gp612) で電子顕微鏡データ バンクに寄託されています。 - gp1512 - gp166 複合体）。

Bazinet, C. & King, J. DSDNA バクテリオファージの DNA 転座頂点。 アンヌ。 Rev.Microbiol. 39、109–129 (1985)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

ニューカム、WW et al. UL6 遺伝子産物は、単純ヘルペスウイルスのカプシドへの DNA の侵入のための入り口を形成します。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 75、10923–10932 (2001)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Tavares、P. バクテリオファージの頭から尾へのインターフェース。 細胞内生化学（Harris, JR & Bhella, D.編）vol. 88、305–328 (Springer、2018)。

Liu、Y.-T.、Jih、J.、Dai、X.、Bi、G.-Q. & Zhou, ZH 単純ヘルペスウイルス 1 型門脈頂点とパッケージングされたゲノムの Cryo-EM 構造。 ネイチャー 570、257–261 (2019)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Dedeo, CL、Cingolani, G. & Teschke, CM ポータルタンパク質: dsDNA 尾部バクテリオファージおよびヘルペスウイルスのキャプシド構築のオーケストレーター。 アンヌ。 ヴィロル牧師。 6、141–160 (2019)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

スミス、DE et al. バクテリオファージのφ29ポータルモーターは、大きな内力に抗してDNAをパッケージングすることができます。 Nature 413、748–752 (2001)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Rao, VB & Feiss, M. 大きな二本鎖 DNA ウイルスによる DNA パッケージングのメカニズム。 アンヌ。 ヴィロル牧師。 2、351–378 (2015)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

クエルボ、A. et al. T7 バクテリオファージのポータルとテールの構造は、ウイルス DNA の保持と排出のメカニズムを示唆しています。 ナット。 共通。 10、3746 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ラーツ、R.ら。 細菌ウイルスの頭から尾までの境界面の構造組織。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 310、1027–1037 (2001)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

オルロバ、EV 他極低温電子顕微鏡によるウイルス DNA ゲートキーパーの構造 (分解能 10 Å)。 EMBO J. 22、1255–1262 (2003)。

AA シンプソンら。 バクテリオファージφ29 DNAパッケージングモーターの構造。 Nature 408、745–750 (2000)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

レベデフ、AA 他。 ウイルスポータルタンパク質を介した DNA 移行の構造枠組み。 EMBO J. 26、1984 ～ 1994 年 (2007)。

サン、L.ら。 原子に近い分解能でのバクテリオファージ T4 ポータルタンパク質集合体のクライオ EM 構造。 ナット。 共通。 6, 7548 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

ジャベド、A.ら。 2 つのバクテリオファージポータルタンパク質の Cryo-EM 構造は、抗菌ファージ工学に関する洞察を提供します。 ウイルス 13、2532 (2021)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Olia, AS、Prevelige, PE、Johnson, JE & Cingolani, G. ウイルスゲノム送達ポータル頂点の三次元構造。 ナット。 構造体。 モル。 バイオル。 18、597–603 (2011)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

マクスウェル、KL et al. 新規フォールドを持つ小さな形態形成タンパク質であるバクテリオファージ λ プロテイン W の溶液構造 11 PE Wright 編集。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 308、9–14 (2001)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Maxwell, KL、Yee, AA、Arrowsmith, CH、Gold, M. & Davidson, AR バクテリオファージの λ 頭尾結合タンパク質、gpFII の溶液構造。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 318、1395–1404 (2002)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Cardarelli、L. et al. バクテリオファージ HK97 gp6 の結晶構造: ヘッドテールコネクタータンパク質の大きなファミリーを定義します。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 395、754–768 (2010)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Lhuillier, S. et al. バクテリオファージ SPP1 の頭と尾の結合の構造により、ウイルス DNA ゲーティングのメカニズムが明らかになります。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 106、8507–8512 (2009)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Chaban, Y. et al. 集合および感染中のファージの頭と尾の境界面における構造の再配置。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 112、7009–7014 (2015)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

バーディ、P. et al. 遺伝子導入剤の DNA 送達の構造とメカニズム。 ナット。 共通。 11、3034 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Leiman, PG、Chipman, PR、Kostyuchenko, VA、Mesyanzhinov, VV & Rossmann, MG 宿主の感染時のバクテリオファージ T4 の尾部におけるタンパク質の三次元再配列。 セル 118、419–429 (2004)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Xu, J.、Wang, D.、Gui, M. & Xiang, Y. 尾部バクテリオファージ ϕ29 の構造アセンブリ。 ナット。 共通。 10、2366 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Lhuillier, S. SPP1 からの DNA 排出の生化学的および構造的研究。 (フランス、パリ南大学、2006)。

Isidro, A.、Santos, MA、Henriques, AO & Tavares, P. バクテリオファージ SPP1 ポータル タンパク質の高解像度機能マップ。 モル。 微生物。 51、949–962 (2004)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Isidro, A.、Henriques, AO & Tavares, P. ポータルタンパク質は、SPP1 DNA パッケージング プロセスのさまざまな段階で重要な役割を果たします。 ウイルス学 322、253–263 (2004)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Oliveira, L.、Henriques, AO & Tavares, P. ポータルタンパク質によるウイルス ATPase 活性の調節は、DNA パッケージング効率と相関します。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 281、21914–21923 (2006)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Cuervo, A.、Vaney, M.-C.、Antson, AA、Tavares, P. & Oliveira, L. 門脈タンパク質サブユニット間の構造再配置は、ウイルスの DNA 転座に不可欠です。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 282、18907–18913 (2007)。

Oliveira, L.、Cuervo, A. & Tavares, P. バクテリオファージ SPP1 パッケージング ATPase とポータルタンパク質との直接相互作用。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 285、7366–7373 (2010)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Krissinel, E. & Henrick, K. 結晶状態からの高分子集合体の推論。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 372、774–797 (2007)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Chen, J.、Sawyer, N. & Regan, L. タンパク質間相互作用: 結合親和性と界面埋没表面積の関係における一般的な傾向。 タンパク質科学。 22、510–515 (2013)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Grimes, S.、Ma, S.、Gao, J.、Atz, R. & Jardine, PJ 後期 DNA パッケージングにおける φ29 コネクタ チャネル ループの役割。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 410、50–59 (2011)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

OW ベイフィールド、AC スティーブンおよび AA アントソンの in situ クライオ EM 構造により、ウイルスをゲノム損失から守る分子スイッチが明らかになりました。 Elife 9、e55517 (2020)。

Liu、G.ら。 Bacillus subtilis 由来のタンパク質 yqbG の NMR 構造により、新規なα-ヘリックスタンパク質の折り畳みが明らかになりました。 タンパク質の構造。 機能。 バイオインフォマ。 62、288–291 (2005)。

記事 Google Scholar

アブレシア、NGA、バンフォード、DH、グライムス、JM & スチュアート、DI 構造はバイラルの世界を統一します。 アンヌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． 81、795–822 (2012)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Li, Z.、Pang, J.、Dong, L. & Yu, X. ヒトサイトメガロウイルスにおけるゲノムのパッケージング、保持、および排出の構造基盤。 ナット。 共通。 12、4538 (2021)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Hrebík, D. et al. 黄色ブドウ球菌ファージP68の構造とゲノム排出機構。 科学。 上級 5、eaaw7414 (2019)。

Lopes, A.、Tavares, P.、Petit, M.-A.、Guérois, R. & Zinn-Justin, S. 首の組織に応じた尾部バクテリオファージの自動分類。 BMC ゲノミクス 15、1027 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Cardarelli、L. et al. ファージは、ビリオン構築における複数の機能を果たすために、同じタンパク質の折り畳みを適応させました。 手順国立アカデミー。 科学。 107、14384–14389 (2010)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Veesler, D. & Cambillau, C. 尾部バクテリオファージの機能モジュールと細菌機構の共通の進化的起源。 微生物。 モル。 バイオル。 改訂 75、423–433 (2011)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Auzat, I.、Petitpas, I.、Lurz, R.、Weise, F. & Tavares, P. バクテリオファージの組み立てを完了するための接着剤のタッチ: 尾頭結合タンパク質 (THJP) ファミリー。 モル。 微生物。 91、1164–1178 (2014)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Seul、A.ら。 バクテリオファージの長く非収縮性の尾の生合成。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 433、167112 (2021)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Liu、Y.ら。 カウドビリテス綱の古細菌ウイルスの多様性、分類、進化。 ＰＬＯＳバイオル。 19、e3001442 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ベッカー、B.ら。 Bacillus subtilis バクテリオファージ SPP1 の頭部形態形成遺伝子。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 268、822–839 (1997)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Jakutyte、L. et al. 桿状グラム陽性菌におけるバクテリオファージ感染: 枯草菌におけるファージ SPP1 侵入の優先極性経路の証拠。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 193、4893–4903 (2011)。

Zheng、SQら。 MotionCor2: 改善されたクライオ電子顕微鏡のためのビーム誘起運動の異方性補正。 ナット。 方法 14、331–332 (2017)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: 電子顕微鏡写真からの高速かつ正確な焦点ぼけ推定。 Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ． バイオル。 192、216–221 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Kimanius, D.、Forsberg, BO、Scheres, SH、Lindahl, E. RELION-2 の GPU を使用した並列化によるクライオ EM 構造決定の加速。 Elife 5、e18722 (2016)。

Punjani, A.、Rubinstein, JL、Fleet, DJ & Brubaker, MA crioSPARC: 教師なしの迅速なクライオ EM 構造決定のためのアルゴリズム。 ナット。 方法 14、290–296 (2017)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Kucukelbir, A.、Sigworth, FJ & Tagare, HD クライオ EM 密度マップの局所解像度を定量化します。 ナット。 方法 11、63 ～ 65 (2014)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

ペッターセン、EF 他。 UCSF Chimera - 探索的研究と分析のための視覚化システム。 Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ． 化学。 25、1605–1612 (2004)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: 分子グラフィックス用のモデル構築ツール。 アクタクリスタログル。 宗派。 Ｄ．Ｂｉｏｌ． クリスタロガー。 60、2126–2132 (2004)。

記事 Google Scholar

アフォニン、PV 他。 PHENIX におけるクライオ EM および結晶学のための実空間リファインメント。 アクタクリスタログル。 宗派。 D. 構造。 バイオル。 74、531–544 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

PyMOL 分子グラフィックス システム、バージョン 2.2.3、Schrödinger, LLC。

Holm、L. DALI、およびタンパク質形状の持続性。 タンパク質科学。 29、128–140 (2020)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

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プロジェクト期間中、Birkbeck でコンピューターをサポートしてくれた D. Houldershaw 博士と Y. Goudetsidis に感謝します。 Cryo-EM サンプルは、Wellcome Trust (079605/2/06/2) からの資金援助を受けて、バークベック大学の ISMB EM 施設で調製および最適化されました。 私たちは、Wellcome Trust、英国医学研究評議会、およびバイオテクノロジーおよび生物科学研究から資金提供を受けている英国国立電子バイオイメージング センター (eBIC、提案書 EM14704) のクライオ EM 施設へのアクセスとサポートについて、Diamond Light Source に感謝します。評議会。 eBIC でのデータ収集にご協力いただいた Y. Chaban 博士に感謝します。 HSV-1 C-キャプシドのサンプルを提供してくれた A. Isidro 博士 (VMS、CNRS、フランス、ギフ・シュル・イベット) と、図に示す顕微鏡写真を提供してくれた R. Lurz 博士 (MPIMG、ベルリン、ドイツ) に感謝します。図 6. この研究の一部は、CNRS からの機関資金によって支援されました。

イーゴリ・オルロフ

現在の住所: グラスゴー大学、スコットランド高分子イメージングセンター、Sir Michael Stoker Building、464 Bearsden Road、Glasgow、G61 1QH、Scotland、UK

これらの著者は同様に貢献しました: Igor Orlov、Stéphane Roche。

統合生物学センター (CBI)、統合構造生物学部門、IGBMC、ストラスブール大学、67404、イルキルシュ、フランス

イーゴリ・オルロフ

パリ・サクレー大学、CEA、CNRS、細胞統合生物学研究所 (I2BC)、91198、ギフ・シュル・イヴェット、フランス

ステファン・ロシュ、サンドリーヌ・ブラジレス、パウロ・タバレス

構造分子生物学研究所、生物科学部、バークベック大学、マレットストリート、ロンドン、WC1E 7HX、英国

ナタリア・ルコヤノワ & エレナ・V・オルロワ

パスツール研究所、パリ シテ大学、CNRS UMR3569、構造ウイルス学ユニット、75015、パリ、フランス

マリー＝クリスティーン・ヴァニー

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EVO と PT は研究を企画、監督しました。 SB は SPP1 DNA が充填されたキャプシドとコネクターを精製しました。 NLがEMグリッドを作成し、IO、EVOがEMデータを解析し、構造解析を行いました。 IO、EVO、SR、MC.V。 マップを分析してモデリングを実行しました。 PT、EVO、SR が原稿を書きました。 IO、EVOSR、M.-CV が図を作成しました。 すべての著者は、結果、数値、および原稿の批判的な読み取りについての議論に参加しました。 著者全員が原稿の最終版を承認しました。

パウロ・タバレスまたはエレナ・V・オルロバとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

この研究には、動物、人間の参加者、またはその組織は関与または使用されていません。 臨床試験は含まれていません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Lotta Happonen 氏、Carolyn Teschke 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Orlov、I.、Roche、S.、Brasilès、S. 他。 細菌ウイルスゲノムゲートキーパーの CryoEM 構造と構築メカニズム。 Nat Commun 13、7283 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-34999-8

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受信日: 2022 年 6 月 17 日

受理日: 2022 年 11 月 15 日

公開日: 2022 年 11 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34999-8

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