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Aug 04, 2023

大環状ペプチドをフラグメント結晶化可能領域にグラフトすることにより薬物動態が強化された受容体アゴニストを設計する

Ingegneria Biomedica della Natura

Nature Biomedical Engineering volume 7、page 164–176 (2023)この記事を引用

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2 引用

444 オルトメトリック

メトリクスの詳細

循環半減期が短く、血液脳関門を通過する輸送が不十分であるため、受容体アゴニストとして機能するサイトカインや成長因子の有用性が制限されます。 今回我々は、ヒト免疫グロブリンの結晶化可能断片（Fc）領域の構造ループに大環状ペプチドファーマコフォアを遺伝的に挿入することによって、循環半減期が長く、血液脳関門を通過する輸送速度が向上した代理受容体アゴニストを生成できることを示す。 我々は、Fc領域の発現レベルと新生児Fc受容体に対するその親和性を維持するこのような「ラッソグラフティング」アプローチを使用して、受容体チロシンプロテインキナーゼMetに結合する大環状ペプチドを含むFcベースのタンパク質足場を生成した。 MetアゴニストはMetを二量体化し、その天然リガンドによって誘導されるものと同様の生物学的応答を誘導した。 さらに、マウス抗トランスフェリン受容体抗体のFc領域にMet結合大環状ペプチドをラッソグラフトすると、マウスの脳実質におけるMetアゴニストの蓄積が増強された。 ラッソグラフティングにより、安定性と薬物動態が強化されたデザイナータンパク質治療薬が可能になる可能性があります。

サイトカインと成長因子の治療薬としての臨床使用は米国食品医薬品局によって承認されており 1,2、神経新生や脳修復などの新興分野での応用の可能性 3,4 は熱心な研究テーマとなっています。 しかし、それらの固有の構造特性により、物理化学的安定性と薬物動態の改善、特に半減期や血液脳関門（BBB）浸透性の改善を目的とした設計が困難となっています。 タンパク質治療薬の薬物動態を制御する既存の方法には、半減期を延長するためのポリ（エチレングリコール）の結合および免疫グロブリンの結晶化可能なフラグメント（Fc）領域との融合が含まれます5、6、7。 抗トランスフェリン受容体（TfR）抗体のFabとの融合により、BBB8、9、10を通過する浸透が強化されます。 ただし、これらの方法がタンパク質の生物活性に悪影響を与えることなく、タンパク質の薬物動態をどの程度改善できるかは、各タンパク質の特性に依存します5、6、7、8。 サイトカインや成長因子の固有の構造的限界を克服するために、天然のリガンドと構造的に無関係な代替アゴニストの開発が進んでいます 11,12。 これらの最近の進歩にもかかわらず、望ましい物理化学的安定性と薬物動態を備えたタンパク質治療薬を設計するための、より堅牢で汎用性の高い方法に対する大きなニーズが依然として満たされていません。

大環状ペプチドは、抗体のような結合親和性と特異性 13,14、独特の化学空間を標的とする能力 15,16,17,18 および合理的な両方による効率的な発見など、多くの望ましい特徴を誇る有望な新規クラスの薬剤候補として浮上しています。 /コンピュテーショナルデザインとインビトロディスプレイ18、19、20、21。 一般に、大環状ペプチドは、環状構造が拘束されているため、直鎖状ペプチドよりも標的に対して高い親和性を示します。 これらの大環状ペプチドの適用性を拡張する興味深い可能性は、それらをタンパク質の足場に「移植」して、ペプチドとタンパク質の機能的な組み合わせを可能にすることです18、22、23、24、25、26。 しかし、新たに同定されたペプチドをタンパク質ループにグラフトすることは、グラフトされたペプチドと宿主タンパク質の両方の潜在的なミスフォールディングのため、困難でした 26。

メッセンジャー RNA ディスプレイと遺伝暗号再プログラミングを統合した RaPID (ランダム非標準ペプチド統合発見) システムの開発により、標的タンパク質に対して絶妙な結合特異性を持つチオエーテルベースの環状大環状ペプチドの発見が可能になりました 16,17,18。 以前の研究で、我々は、RaPID 由来のファーマコフォア配列がタンパク質の表面に露出したループに容易に移植でき、ゲストペプチドとホストタンパク質の両方の機能を維持できることを示しました。これを「ラッソグラフティング」と名付けました 27,28,29 。 観察された例外的なグラフト適合性は、おそらく、足場タンパク質の無関係なループ構造の状況下であっても、親大環状構造と同様の標的結合立体構造に自己折り畳みするファーマコフォアモチーフの固有の特性によるものである18,30。

この研究では、Fc フラグメントの望ましい足場特性、その長い半減期、Fab5、6、31、32 と組み合わせた多用途性、および製造の容易さを活用して、ラッソグラフティングの実現可能性と応用を示します。 Fcを足場として使用して、顕著に改善された半減期とBBB浸透度を特徴とするMet受容体アゴニストを生成しました。

Met は、そのリガンドである肝細胞増殖因子 (HGF) によって引き起こされる二量体化によって活性化される受容体チロシンキナーゼです。 Met-HGF は、細胞の成長、生存、遊走を刺激することにより、発生中の形態形成、創傷修復、臓器の恒常性維持に中心的に関与しています 33,34。 組換え HGF タンパク質は、前臨床モデル 34,35 および特定の疾患を持つ患者において治療効果を示します 36,37。 しかし、半減期が短く、BBB を超えて送達できないため、医療用途での可能性は長い間制限されてきました 38,39。 これらの欠点に対処するために、我々は、Met40の外部ドメインに結合する2つの大環状ペプチドであるaMD4またはaMD5の線形化ファーマコフォア配列をFcの8つのループのそれぞれにラッソグラフトすることによって挿入した（図1a）。 これら 2 つの一連の aMD4 または aMD5 グラフト Fc フラグメント (以下、それぞれ Fc(aMD4) および Fc(aMD5)) は、それぞれ互いに 31 ～ 42 Å 以内に 2 つの Met 結合体を示し、表面上の 2 つの Met 受容体に近接する可能性があります。細胞表面。 Expi293F 細胞における Fc(aMD4) および Fc(aMD5) の発現レベルは、Fc(aMD5)T3 を除いてコントロール Fc の発現レベルと同様でした (拡張データ図 1)。 Fcの高発現。

a、Met バインダーのファーマコフォア配列 (aMD4 または aMD5; 赤で表示) を、ヒト IgG1 Fc タンパク質 (PDB ID: 1h3w) のループ (T1 ～ B3; 色付き) に挿入しました。 Fc、グラフトペプチド、グラフト部位のアミノ酸配列を右側に示します。 b、c、aMD4移植Fc（Fc(aMD4)）（b）またはaMD5移植Fc（Fc（aMD5））（c）による細胞Met活性化。 EHMES-1 細胞は、Fc 変異体 (色付き) またはダイマーペプチド (灰色) で処理されました。 細胞の Met 活性化を、抗リン酸化 Met (Tyr1234/1235) 抗体を用いて in situ で定量しました。 結果は、1.1 nM HGFによって誘導された最大Metリン酸化に対するホスホ-Metの割合の平均±sem（n = 6の独立した実験）として示されている。 左: T1、T2、および T3。 中央: M2 と M3。 右：B1、B2、B3。

ソースデータ

精製されたFc（aMD4）またはFc（aMD5）による細胞Metの活性化は、移植部位に大きく依存し（図1b、c）、B3はaMD4の最適部位でした（図1b）。 我々の分析では、Fc(aMD4)B3 が非グラフト化 aMD4 ダイマーペプチドの最大有効濃度の半分 (EC50) で Met を活性化し (EC50: それぞれ 4.5 ± 0.2 nM 対 5.1 ± 0.6 nM)、最大有効濃度がわずかに減少したことを示しています。 HGF 誘導リン酸化と比較した活性化 (それぞれ 74.8% ± 0.4% vs 101.3% ± 0.1%)。 対照的に、aMD4 を他のループにグラフトすると、aMD4 二量体ペプチドと比較して Met 活性化が低下しました。 aMD5 の場合、B1 が最良の移植部位であり、Fc(aMD5)B1 は移植されていない aMD5 ダイマーペプチドと比較して 3.7 倍高い EC50 で Met を活性化し、最大活性化はわずかに低くなりました (EC50: 16.6 ± 1.6 nM vsそれぞれ4.5 ± 0.2 nM; 最大活性化: それぞれ76.2% ± 1.4% vs 105.0% ± 4.2%; 図 1c)。 aMD5 を他のループに移植すると、Met 活性化が減少または消失しました。 注目すべきことに、ラッソ移植されたFcのアゴニスト活性は、細胞表面Met（補足図1a）またはMet外部ドメインフラグメント（MetECD）（拡張データ図2および補足図1b）への結合強度とよく相関しており、それらの有効性が示されています。は主に Met への親和性によって決まります。 2つのペプチドのグラフト部位依存性の違いは、おそらくMet外部ドメイン上の結合部位の違いとFc構造におけるそれらの異なる空間配置によって課される立体効果によるものと考えられます（補足図2）。

アゴニスト活性を改善するために、aMD4配列の各末端にCys残基を付加し、ジスルフィド結合を介して密に閉じた大環状構造を促進しました（図2aおよび補足図3）。 T1 および B3 でジスルフィド結合した誘導体 aMD4 (以下、接頭辞「ds」) は、対照よりも大きな最大 Met 活性化を示しましたが (T1、P = 0.039; B3、P < 0.0001)、EC50 では効果は観察されませんでした (補足)図3f)およびMetECD結合の解離定数(KD)値(拡張データ図2)。 対照的に、dsB2はアゴニスト活性、最大活性化、またはEC50値の改善を示さなかった（補足図3f）。これは、これら2つの部位へのグラフト後のMet親和性の低下は、グラフトされたペプチドモチーフ自体の次善の立体構造によるものではないことを示唆している。 これは、B1またはB3位置にグラフトされた場合のaMD4またはaMD5の同様の立体構造によってさらに裏付けられました（補足図2）。

a、EHMES-1細胞においてFc(aMD4)B3、Fc(aMD4ds)B3およびHGFによって誘導される、ホスホMet(Tyr1234/1235)によって測定される細胞Met活性化。 結果は平均値 ± 標準誤差 (n = 3 回の独立した実験) として示されています。 b〜g、Fc(aMD4)B3によって誘導される肝細胞応答は、HGFによって誘導される応答に匹敵します。 b、HGF、Fc(aMD4)B3、またはコントロールFc (100 nM)で処理したヒト肝細胞における細胞シグナル伝達。 ライセートをウェスタンブロッティングによって分析しました。 c、Metに対するFc(aMD4)B3の選択性を示すリン酸受容体チロシンキナーゼアレイ。 ヒト肝細胞は、HGF、Fc(aMD4)B3、または Fc で刺激されました。 d〜g、Fc(aMD4)B3およびHGFによって誘導される初代ヒト肝細胞スフェロイドにおける同様の遺伝子発現プロファイル。 d、HGFまたはFc(aMD4)B3による肝細胞スフェロイドの誘導および刺激のスキーム。 代表的な画像を示します。 スケールバー、200 μm。 e、24時間でのHGFおよびFc(aMD4)B3によって誘導される遺伝子発現変化の間の相関を示す散布図。 青い点線は回帰直線を示します。 f、未処理肝細胞スフェロイドと比較したHGFまたはFc(aMD4)B3処理肝細胞スフェロイドのDEGのヒートマップ(グループあたりn = 2、偽発見率(FDR) < 0.05、Benjamini-Hochberg、両面)。 g、未処理の対照と比較した、HGFまたはFc（aMD4）B3処理肝細胞スフェロイドのDEGの代表的な有意に濃縮されたGO用語とそのヒートマップ（24時間、FDR < 0.05、Benjamini-Hochberg、両面）。

ソースデータ

EHMES-1細胞または肝細胞においてFc(aMD4)B3によって誘導される細胞応答は、HGFの応答と非常に同等でした(図2および拡張データ図3)。 1 nMのFc（aMD4）B3は、Y1234 / 1235でMetのリン酸化を誘導し、HGFによって誘導されるものと同等のレベルでAktおよびErk1 / 2のリン酸化により、その後の下流シグナル伝達を活性化しました（図2bおよび補足図4）。 Metの3つの異なるチロシン残基におけるFc(aMD4)B3およびHGFによって誘導されるリン酸化のレベル、ならびにMet、AktおよびErk1/2リン酸化の誘導動態は同等でした(拡張データ図3)。 Metに対するFc(aMD4)B3の選択性は、49個の受容体のチロシンリン酸化の調査によって確認されました(図2cおよび補足図5)。 Fc(aMD4)B3 または HGF によって誘導される遺伝子発現の変化は、初代ヒト肝細胞スフェロイド培養物において RNA-seq によって検査されました (図 2d–g)。 散布図は、未処理のスフェロイドと比較した、HGFおよびFc(aMD4)B3によって誘発された遺伝子発現変化の相関関係を示しています(図2e)。 最後に、未処理のスフェロイドと比較した差次的発現遺伝子（DEG）のヒートマップは、Fc（aMD4）B3とHGFの両方が同様に2,000を超える転写産物の発現を変化させ（図2f）、遺伝子オントロジー（GO）が大幅に強化されたことを示しています。創傷治癒と肝機能に関連する用語（図2g）。

新たに生成されたペプチドは、天然リガンドとは完全に異なる方法で標的受容体に示差的に結合する可能性があるため、理論的には天然リガンドと競合しないアゴニスト、またはリガンド結合を欠く変異受容体を活性化できるアゴニストを生成することができます。 この可能性を調査するために、まず、aMD4の特異性を利用して、ヒトとマウスのMetECDを可変的に融合したキメラMetECDフラグメントを使用して、推定上のFc（aMD4）B3結合部位（図3aの赤で示されている）をマッピングしました（拡張データ図4）。人間のMet40の場合。 推定上の結合部位は Met の Sema ドメインの下面にマッピングされており、HGF 結合部位と重複しない 41。これにより、なぜ aMD4 ペプチドが HGF 誘導性 Met 活性化と競合しないのかが説明されます 40。

a、SemaドメインにおけるFc(aMD4)B3の結合に必須の残基(赤)および補助残基(オレンジ)(PDB ID: 1shy)。 HGF の SP ドメインは黄色で示されています。 予測モデルから外部ドメイン構造を満たしました (PDI ID: Sema から IPT1 までは 1ux3、IPT2 から IPT4 までは 2cew)。 b、インビトロでのFc(aMD4)によるMet二量体形成。 MetECD と Fc(aMD4) またはコントロール Fc 間の複合体を BS3 で架橋し、非還元条件下で SDS-PAGE および銀染色で分析しました。 c〜f、Fc（aMD4）B3（c）、MetECD（d）、およびFc（aMD4）B3によって誘導されたMet二量体の2：1複合体の代表的な連続HS-AFM画像（e、f）。 HS-AFM 画像の概略的な解釈を e と f (上のパネル) に示します。 矢印は Sema ドメインを示します。 複合体の精製を拡張データ図 5c に示します。 各サンプルについて少なくとも 5 つの分子または複合体が観察されました。 色 (黒から白) は、分子の高さの増加に対応します。 スケールバー、20 nm。 これらの実験は独立して 2 回繰り返され、同等の結果が得られました。

次に、Fc(aMD4)によって誘導されるMet二量体の構造を調べました。 MetECDとFc（aMD4）の間の複合体は、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）を使用した架橋によって安定化し、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分析されました（図3bおよび拡張データ図5a、b）。 結果は、MetECD と Fc(aMD4) が 1:1 または 2:1 の化学量論で複合体を形成していることを示しました。 2:1 シグナル伝達複合体の形成におけるさまざまな Fc(aMD4) の相対効率は、B3 > B1 > B2 の順であり、細胞 Met を活性化する能力とよく相関していました。 MetECD と Fc(aMD4)B3 の BS3 架橋 2:1 複合体をサイズ排除クロマトグラフィー (拡張データ図 5c) で精製し、高速原子間力顕微鏡 (HS-AFM) による単一分子検査を行いました 42。 Fc および MetECD をコントロールとして使用します（図 3c ～ f および補足ビデオ 1 ～ 4）。 HS-AFM では、MetECD は球状の Sema ドメインと Ig 様、プレキシン、転写因子 (IPT) ストーク ドメインを示し、各 IPT ドメインの相対的な位置は柔軟でした (図 3d および補足ビデオ 2)。 Fc（aMD4）B3はSemaドメインの下面に結合し、2つのMet分子を架橋しながら、IPTストークドメインを噴霧して取り除くか（図3eおよび補足ビデオ3）、または付着させます（図3fおよび補足ビデオ4）。 IPT ドメインの柔軟性により、おそらく 2 つの Met 分子の細胞内キナーゼドメインの適切な会合が可能となり、この会合は Met の活性化に不可欠です 33,34。 これらの結果は、Fc(aMD4)B3 が HGF とは異なる部位で Met に結合する一方で、近接した 2 つの Met 受容体を動員することで HGF と同程度に Met を活性化できることを示しています。

Fc および抗体の長い半減期は、主に FcRn43、44、45、46 への結合によって維持されます。 したがって、FcRn結合部位から遠位のループ位置に選択的にラッソグラフトしました（図4a）。 したがって、Fc(aMD4) と固定化 FcRn の間の結合速度論の分析では、Fc(aMD4)T2 および M2 はコントロール Fc よりわずかに高い KD 値を示したものの、ほとんどのループへのラッソグラフトは Fc の FcRn への親和性に影響を及ぼさないことが示されました (図4bおよび拡張データ図6)。 これは、Fc へのラッソグラフトが FcRn に対する Fc の親和性を維持することを示唆しています。

a、Fc (灰色) のペプチド挿入ループ (T1 ～ B3) は、FcRn (オレンジ) および β2-ミクログロブリン (β2M、黄色) への結合部位から離れて設計されています (PDB ID: 4N0U)。 b、表面プラズモン共鳴によって決定されたFcRn/β2Mに対するFcおよびFc(aMD4)のKD値。 結果は平均±標準誤差（3 濃度の分析物の重複；対応のない両側 t 検定）として示されます。 c、d、Fc(aMD4)B3 はマウスにおいて長い血清半減期を示しました。 野生型 C57BL/6 マウス (c) または mFcRn-/- hFcRn+ マウス (d) に、1 kg あたり等モル量の Fc (0.7 mg kg-1)、Fc(aMD4)B3 (0.74 mg kg) を単回注射しました。 −１）またはＨＧＦ（１．０ｍｇ ｋｇ−１）を尾静脈経由で投与し、血清濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。 結果は、個別の値（グループあたり n = 6 マウス）（c）または平均±標準誤差（d）（グループあたり n = 10 マウス）として示されています。 HGF については、一部のサンプルが検出限界を下回りました。 e-j、ヒト化肝臓を持つマウス（PXBマウス）におけるFc（aMD4）B3のin vivo活性。 e、回路図。 f、g、複製 DNA 合成。 f、Fc(aMD4)B3またはPBSで処理したマウスの肝臓におけるBrdU染色を示す代表的な画像。 スケールバー、100 μm。 g、肝臓内のBrdU+細胞の割合。 結果は、平均値±標準誤差（群あたり n = 4 匹のマウス；対応のない両側 t 検定）として表示されます。 h–j、遺伝子発現プロファイル。 h、Fc（aMD4）B3処理およびPBS処理PXBマウス肝臓間のDEGのヒートマップ（グループあたりn = 4マウス、FDR < 0.01、Benjamini-Hochberg、両面）。 i、j、PBS処理対照と比較したFc(aMD4)B3処理肝臓のDEGの濃縮倍数(i)または遺伝子数(j)に関する代表的な濃縮GO用語(FDR < 0.01、Benjamini-Hochberg、2) -サイド)。

ソースデータ

次に、野生型マウスにおける、1kgあたり等モル量の単回静脈内（iv）投与後のFc（aMD4）B3の血清半減期を、対照FcおよびHGFの血清半減期と比較して評価しました（図4c）。 HGF の血清濃度は 1 時間以内に 0.01 nM 未満に減少し、Met を活性化できなくなりました。 対照的に、Fc(aMD4)B3は、対照Fcの半減期に匹敵する長い半減期を示した(図4c)。 ヒト Fc ベースのバリアントの薬物動態を正確に決定するために、mFcRn-/- hFcRn+ マウスで Fc(aMD4)B3 とコントロール Fc の血清半減期を測定しました 47 (図 4d)。 これらのマウスにおけるFc(aMD4)B3の血清半減期は49.4時間であり、対照Fcの血清半減期(46.6時間)と同等であった。 Fc(aMD4)B3の血清濃度は、0.74 mg kg-1での単回静脈内投与後最大200時間、Metを活性化するための最小濃度である1 nMを超えて維持されました（図2a、b）（図4d）。

次に、Fc(aMD4)B3 はマウス Met40 を活性化できないため、Fc(aMD4)B3 の in vivo 活性を、肝細胞の約 80% がヒト化されたヒト肝細胞を移植されたキメラ マウス (PXB マウス) を使用して調べました 48。 我々は最初に、5 mg kg-1 での 1 回の iv または皮下 (sc) 注射後の PXB マウスにおける Fc(aMD4)B3 の血清半減期の延長を確認しました (補足図 6)。 続いて、PXB マウスに Fc(aMD4)B3 または PBS を 1 回皮下注射した 46 時間後のヒト肝細胞の増殖と遺伝子発現を分析しました（図 4e-j）。 Fc（aMD4）B3は、PBSで処理した対照マウスの複製と比較して、肝細胞の複製DNA合成を有意に増加させました（それぞれ3.73％±0.31％対0.37％±0.07％、P <0.0001）（図4f、g）。 Fc(aMD4)B3処理肝臓とPBS処理肝臓間のDEGのヒートマップは、Fc(aMD4)B3が3,200を超える転写産物の発現を変化させることを示した(図4h)。 それらの中で大幅に濃縮されたGOタームは、主に有糸分裂DNA複製/細胞周期および代謝プロセスに関与していました（図4i、j）。 まとめると、これらの結果は、投げ縄移植により、未修飾Fcの半減期に匹敵する顕著に改善された半減期を有する、生体内で生物活性であるMet活性化Fcを生成したことを示している。

HGF 誘導性の Met 活性化は、脳虚血、脊髄損傷、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症などの神経病理の前臨床モデルにおいて有益な神経保護効果を発揮することが報告されています 35。 以前の研究と同様に、Metがマウスの脳のニューロンで発現していることを確認しました（補足図7）。 BBB を通過できる Met アゴニストを生成するために、我々は、単一または二重 Fab 構成 (sTfR(aMD4) および dTfR(aMD4)、それぞれ）（図5a、bおよび補足図8）。 ラッソグラフティングは、以前に報告されたこれらの抗体の mTfR に対する親和性を有意に変化させず、Fab 親和性がほぼ保存されていることを示唆しています (図 5c)。 対照的に、sTfR(aMD4) と dTfR(aMD4) は両方とも Fc(aMD4) と比較して Met 活性化の低下を示し、EC50 値は 9.6 倍および 18.7 倍減少しました (20.2 ± 3.4 nM vs 39.2 ± 22.3 nM vs 2.1 ± 0.2 nM)。 、それぞれ）（図5d）。 これはおそらく、sTfR(aMD4) および dTfR(aMD4) 上の大きな Fab アームの存在によるもので、細胞表面でのそれらの結合および/または Met の二量体化を妨げた可能性があります。

a、Fc(aMD4)、dTfR(aMD4)、およびsTfR(aMD4)の概略図。 すべての変異体は、ヒト IgG Fc の B3 ループに aMD4ds を移植されました。 ラット抗マウストランスフェリン受容体 Fab を Fc(aMD4) と融合させました。 b、精製されたバリアントのSDS-PAGE。 c、抗TfR抗体上のaMD4のラッソグラフトはTfRに対する親和性を保存した。 マウス TfR (mTfR) に対する Fc(aMD4)、sTfR(aMD4)、および dTfR(aMD4) の見かけの KD 値 (nM 単位) は ELISA によって決定され、平均 ± sd として表示されます (n = 3 回の独立した実験)。 d、aMD4移植抗TfR抗体による細胞Met活性化。 EHMES-1 細胞を Fc(aMD4)、sTfR(aMD4)、または dTfR(aMD4) で処理しました。 細胞のMet活性化は、抗リン酸Met（Tyr1234/1235）抗体を用いてin situで定量され、平均±sdとして表されました（n = 3回の独立した実験）。 EC50値(nM)が示されている。 e-j、aMD4移植抗TfR抗体のBBB透過。 Fc(aMD4)の単回注射後24時間の概略図(e)、脳濃度(f)、脳1グラム当たりの注射用量パーセンテージ(g)、血清濃度(h)および脳対血清比(i)、 sTfR(aMD4) または dTfR(aMD4) を kg あたり等モル量 (それぞれ 12、20、および 26.5 mg kg-1) 尾静脈経由。 結果は平均値±標準誤差（群あたり n = 4 匹のマウス；対応のない両側 t 検定）として示されています。 j、尾静脈を介したFc(aMD4)、sTfR(aMD4)またはdTfR(aMD4)の単回注射後24時間のマウスの脳切片の免疫組織化学的染色の代表的な画像。 脳実質における sTfR(aMD4) の広範囲の染色と NeuN 陽性神経細胞体の周囲の局在に注目してください。 dTfR(aMD4) の染色は、神経細胞体よりも内皮細胞でより顕著でした。 スケールバー、50 μm。

ソースデータ

最後に、1kgあたり等モル量のタンパク質を治療上適切な用量で単回静脈内投与した後の、野生型マウスにおける3つのaMD4移植バリアントのBBB浸透を調べました（図5e-j）。 静脈注射後２４時間のＰＢＳ灌流脳または血清中のそれらの濃度を、ヒトＩｇＧ ＦｃのＥＬＩＳＡによって測定した。 3 つのバリアントのうち、sTfR(aMD4) は、脳 1 グラムあたりの注射用量の割合 (0.96% ± 0.07%)、脳対血清比 (8.3% ± 0.7%)、および最高の脳濃度 (10.7 ± 0.7%) を示しました。 1.2 nM）（図5f–i）、これはMetの活性化に十分です（図5d）。 これらの結果は、脳内の低親和性抗 TfR 抗体蓄積に関する以前の報告と一致しています 9、10、50。 比較すると、これらの値は dTfR(aMD4) では大幅に低く、Fc(aMD4) ではほぼ無視できました (図 5f-i)。 ELISAによって決定されたより高い脳濃度と一致して、sTfR（aMD4）はNeuN、GFAPおよびIba1と共局在する顕著な実質染色を示し、それぞれニューロン、アストロサイトおよびミクログリアへの分布を示しました（図5j（中右）および補足図）。 .9）。 比較すると、dTfR（aMD4）は、脳内皮細胞における高親和性抗TfR抗体の蓄積に関する以前の報告と一致して、神経染色はそれほど広範囲ではなく、内皮染色がより多かった（図5j（右））。 最後に、Fc(aMD4)は脳実質では検出されませんでした(図5j(中央左))。 前臨床モデルにおける sTfR(aMD4) の将来の治療評価には、時間経過を含む詳細な薬物動態プロファイルのさらなる評価が必要となります。 総合すると、これらの観察は、抗mTfR抗体のFc上でのMet結合大環状ペプチドのラッソグラフト化によってBBB透過性Metアゴニストを生成したことを示した。

新規に同定されたペプチドをグラフトして、その安定性と生物学的利用能を向上させることが、さまざまな足場で試みられてきました 23、24、25、26。 これらの過去の研究により、グラフトの成功はグラフトされたペプチドと足場タンパク質の間の組み合わせと適合性に大きく依存することが明らかになりました 25,26。 したがって、足場タンパク質の選択は、人工産物に代謝安定性や細胞透過性などの望ましい特性を与えながら、ペプチドグラフトの成功を決定するため、重要な考慮事項です24、25、26。 この広範な望ましい特徴に応えるために、ジスルフィド安定化ペプチドおよびミニタンパク質が、ペプチドグラフトのための特殊な足場として機能するように操作されてきました 23、24、25、26。 しかし、これらの特殊な足場は、それ自体に特定の生物活性を持たない小さな非ヒトタンパク質です。 天然のヒトタンパク質はペプチド移植のための望ましい足場であるが、これまでのところ、新たに同定されたペプチドを天然のヒト足場に移植する試みは非常に限られている。 この背後にある主な理由は、新規に同定された合成ペプチドを天然の足場の独立して折りたたまれたドメインに移植すると、多くの場合、両方のエンティティのミスフォールディングと不活性化が生じる可能性があることです。 したがって、我々のこれまでのデータが、新たに同定された大環状ペプチドの天然足場のタンパク質ループへの機能的グラフティングが以前に予想されていたよりもはるかに実現可能であることを示していることは注目に値する27、28、29。

Fc は、発現量が高く、製造が容易で、半減期が長く、Fab 適合性があるため、タンパク質の足場として非常に望ましい 5、6、31、32。 この研究では、Fc に大環状ペプチドをラッソグラフトすることにより、半減期と BBB 透過性が延長された Met 受容体アゴニストが得られたことを報告します。 Fc へのラッソグラフトの適用により、このアプローチの 3 つの重要な強みが明らかになりました。まず、ラッソグラフトにより、発現レベル、FcRn 親和性、および Fab 適合性の点で Fc の全体的な生化学的特性が保存されました。 第二に、ラッソグラフトされた大環状ペプチドは、ジスルフィド結合がなくても、親の大環状立体構造をほぼ保存していました。 第三に、Fc には適切な挿入位置の幅広い選択肢があります。 私たちの研究はさらに、グラフト化ペプチドの標的親和性が部位依存性であることを示しました。 例えば、我々の研究ではTループの有効性が低かったが、これはおそらく、グラフトされたペプチドの標的タンパク質Metへの結合を妨げる可能性のあるN末端ヒンジ領域の存在が原因であると考えられる。 しかし、これらのループは、他の受容体バインダーの適切なグラフト位置として機能しました 27,29。 それにもかかわらず、大環状ペプチドとFcの間の強固なグラフト適合性は、挿入位置の幅広い選択と組み合わせて、ラッソグラフトをFc工学の特に効果的なアプローチにする。

我々の発見の重要な意味は、特定の特性を備えたラッソグラフトタンパク質足場が、タンパク質足場の選択に基づいて望ましい特性を備えたデザイナー受容体アゴニストを設計するためのフレームワークとして機能する可能性があることです。 このことの実証として、我々は抗 TfR 抗体をラッソグラフトすることによって BBB 透過性アゴニストを生成し、それによって確立された BBB 透過技術を活用しました 8,9,10。 現在、ブロッキング特性を備えた抗 TfR Fab 融合抗体の開発にはいくつかの取り組みが行われていますが、アゴニスト抗体の開発を試みているものはわずかです 51。 ラッソグラフティングは、アンタゴニスト抗体に加えて、アゴニスト BBB 透過抗体の設計にも使用できます。 さらに、現在の BBB 透過抗体の 1 つの大きな欠点は、脳対血清比が低く、循環半減期が長いため、全身濃度が長期間にわたって望ましい範囲を超えることが多いことです。 これは、特に標的分子が他の組織において機能的に重要である場合、望ましくない新免疫原性または副作用を引き起こす可能性があります。 ラッソグラフティングでは、抗 TfR Fab などの半減期の短い足場タンパク質に機能性ペプチドを直接グラフトすることで、これを回避できます。

タンパク質を修飾することによってタンパク質治療薬の薬物動態を改善する既存の方法とは対照的に、ラッソグラフト法は、よく理解されているタンパク質の足場に小さなペプチドに由来する新しい機能を付与するため、生物活性の低下、タンパク質の好ましくない特性などの潜在的な落とし穴を回避します。製造用、またはタンパク質融合またはポリ（エチレングリコール）から生じる新免疫原性5、6、7。 Fc はその免疫抑制特性により優れた足場として機能します 52 が、ラッソグラフト化タンパク質の免疫原性、安全性、有効性は医薬品開発の一環として今後の評価が待たれます。 同様に、HGF は非アルコール性脂肪性肝炎 53,54 や神経学的病状 35,37 などのさまざまな疾患の前臨床モデルにおいて治療効果を示しています。 この研究で生成された投げ縄移植された Met アゴニストの治療上の利点も同様に、疾患モデルでさらに評価される必要があります。

強力な生理活性があり、グラフト適合性のある大環状ペプチドの急速な進歩を考慮すると、ラッソグラフト法は、望ましい物理化学的安定性と薬物動態を備えたデザイナータンパク質治療薬の生成や、多機能タンパク質や抗体の操作において大きな期待を抱いています。

ペプチドグラフト Fc タンパク質を設計するために、Fc タンパク質の構造を検査して、露出したループ内に位置する 2 つのアンカー ポイント残基間のおおよその距離が 7 Å 未満である適切な挿入点を見つけました。 コントロールまたは Met 結合大環状ペプチド (aMD4 または aMD5) 移植 Fc の構築には、ヒト IgG1 Fc (残基 104 ～ 330、Uni-Prot P01857) をタグなしで使用しました。 これらの同定された部位（Ｔ１〜Ｂ３）には、両末端にＣｙｓおよびＧｌｙの２つのスペーサー残基が付加されたまたは付加されていないａＭＤ４またはａＭＤ５の内部配列が挿入された。 B3部位にMD4ds挿入を有する抗マウスTfR抗体の構築には、ラット抗マウスTfRモノクローナル抗体(クローン8D3)49のFabフラグメントを使用した。 8D3のVHからCH1までの断片をFc(aMD4)のN末端に融合させて、dTfR(aMD4)の重鎖(HC)を生成した。 8D3 の VL から CL フラグメントを使用して軽鎖 (LC) を生成しました。 sTfR(aMD4)の構築のために、Fc(aMD4)のN末端にフラグタグを付加した。 s/dTfR（aMD4）に使用されるアミノ酸配列は補足図8にあります。すべての発現コンストラクトは、適切なシグナルペプチドを備えたpcDNA3.1ベースのバックボーンを使用して作成され、すべての発現コンストラクトのコード領域はDNA配列決定によって検証されました。 。 タンパク質発現は、Expi293 発現システム (Thermo Fisher) を使用して実行されました。 分泌タンパク質は、HiTrap Protein A HP カラム (Cytiva) で 0.1 M クエン酸-クエン酸ナトリウム緩衝液 (pH 3.5) での溶出を使用して精製し、続いて中和、リン酸緩衝食塩水 (PBS) に対する透析、および Superdex でのサイズ排除クロマトグラフィーを行いました。 200 Increase 10/300GL カラム (Cytiva) を PBS で平衡化します。 アッセイで使用される精製 Fc バリアントの SDS-PAGE 分析と純度は、補足図 10 にあります。 sTfR(aMD4) の発現と精製には、3 つの DNA (TfR(aMD4) HC、TfR(aMD4) LC、および Fc) (aMD4))を使用して Expi293F 細胞を同時トランスフェクトし、sTfR(aMD4)、dTfR(aMD4)、および Fc(aMD4) の混合物を生成しました。 ｓＴｆＲ（ａＭＤ４）を、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラムでの連続抗Ｆｌａｇアフィニティー精製およびサイズ排除クロマトグラフィーによって後者の２つの成分から精製した。

EHMES-1 ヒト中皮腫細胞を、96 ウェル黒色 µClear プレート (Greiner Bio-One) にウェルあたり 8,000 細胞で播種し、10% ウシ胎児血清 (FBS) を添加した RPMI1640 培地で 24 時間培養しました。 細胞を、10% FBS を添加した RPMI1640 培地中の各タンパク質で 10 分間または指定の時間刺激し、氷冷 PBS で洗浄し、PBS 中の 4% パラホルムアルデヒドで 30 分間固定し、PBS で洗浄し、5% ヤギ血清でブロックしました。 0.02% Triton X-100 を含む PBS で 30 分間。 Met、Akt、または Erk1/2 のリン酸化は、抗リン酸化 Met (Tyr1234/1235) 抗体 (1:1,000 希釈、D26、Cell Signaling Technologies)、リン酸化 Akt (S473) (1:1,000 希釈、D9E、 Cell Signaling Technology）またはリン酸化 Erk1/2（T202/Y204）（1:1,000 希釈、D13.14.4E、Cell Signaling Technology）、および西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）結合抗ウサギヤギ抗体（1:1,000 希釈、ダー子）。 次に、ImmunoStar LD試薬（Wako）で発色した化学発光をARVO MXプレートリーダー（Perkin Elmer）を用いて測定した。

Met ノックアウト CHO 細胞および Met 再構成 CHO 細胞 27 へのペプチド移植 Fc タンパク質の結合は、フローサイトメトリーを使用して検出されました。 0.25% トリプシンおよび 1 mM エチレンジアミン四酢酸で簡単に処理することで細胞をディッシュから剥がし、ウェルあたり 200,000 細胞でプレーティングし、5% を含む Ham's F-12 培地 100 ml で 10 mg ml-1 に希釈したペプチドグラフト Fc タンパク質とともにインキュベートしました。 FBSを氷上で1.5時間。 氷冷 PBS で 2 回洗浄した後、細胞を Alexa Fluor 488 標識ヤギ抗ヒト IgG (5% FBS を含む Ham's F-12 培地 100 μl で 1:400 希釈、Thermo Fisher、A11013) とともに氷上で 30 分間インキュベートしました。分、その後 EC800 システム (Sony) で分析しました。 前方散乱対側方散乱のゲートは、補足図11に示すように、すべての細胞集団を含むように設定されましたが、破片と死細胞は除外されました。データはFlowJoソフトウェア（Tomy Digital Biology）で分析されました。

ヒト Met の外部ドメイン フラグメント (MetECD、1 ～ 931) を C 末端でビオチン アクセプター配列 (SSLRQILDSQKMEWRSNAGG) と融合し、Expi293F 細胞内でビオチン リガーゼ (BirA) と共発現させて、BirA 媒介生合成ビオチン化を達成し、上に固定化しました。 ~210 共鳴単位 (RU) の表面密度のシリーズ S Biotin CAPture チップ (Cytiva)。 FcおよびペプチドグラフトFcの結合は、ランニングバッファー（20 mM HEPES-NaOH (pH 7.5)、150 mM NaCl、0.05% Tween 20）を使用して段階希釈した検体溶液を注入することによって評価しました。 実行は、次のパラメータを使用するシングルサイクル速度論モードで実施されました：流速30μl min-1、接触時間120秒、および解離時間300秒。 各実行後、応答が元のベースライン レベルに戻るまで、再生バッファー (6 M グアニジン-HCl、250 mM NaOH) を注入することによって表面を再生しました。 結合曲線は、測定セル (MetECD で固定化) の RU から参照セル (固定化されていない) の RU を差し引くことによって得られ、速度論的結合値を導出するために使用されました。 データは、Biacore T200 機器 (Cytiva) を使用して 25 °C で取得し、結果は Biacore T200 評価ソフトウェア v3.2 (Cytiva) を使用して分析しました。 ビオチン化ヒト FcRn/β2M (ACROBiosystems) をストレプトアビジンでコーティングしたチップ (Cytiva) の表面に 180 ～ 220 RU で捕捉しました。 分析物をランニングバッファー (50 mM リン酸塩 (pH 6.0)、150 mM NaCl、0.01% Tween 20) で希釈し、30 μl min-1 で 1 分間注入し、その後 0.7 分間解離させました。 結合曲線は、測定セル (FcRn/2M で固定化) の RU から参照細胞 (固定化されていない) の RU を差し引くことによって取得し、軸ゼロ化に続いて、センサーグラムを局所的に 1:1 ラングミュア結合モデルにフィットさせました。 データは、Biacore 3000 機器 (Cytiva) を使用して 25 °C で取得し、結果は BIAevaluation ソフトウェア v4.1 (Cytiva) を使用して分析しました。

B1またはB3ループにaMD4またはaMD5が挿入されたFcのCH3ドメインの構造は、MMseqs255のColabFoldおよびAlphaFold2を使用して予測されました。

トリプシン消化とLC-MS/MS分析はカネカテクノリサーチによって行われました。 PBS中の100μgのFc(aMD4ds)T1またはFc(aMD4ds)B3を、8M尿素(富士フイルム和光純薬)を含む100mM重炭酸アンモニウム(Sigma-Aldrich)で処理した。 Amicon Ultra デバイス (MWCO: 10 K、Millipore) を使用して脱塩した後、10 μg の各タンパク質をトリプシン (Promega) で非還元条件下、37 °C で 12 時間消化しました。 ギ酸を添加することにより反応を停止させた。 サンプルを、ESI イオン化源を備えた SCIEX TripleTOF 6600 システム (AB SCIEX) に接続された Nexera X2 UHPLC システム (島津製作所) に注入しました。 ペプチドは、移動相 A (0.1% ギ酸を含む水) と移動相 B (0.1% ギ酸を含むアセトニトリル (富士フイルム和光純薬)) の直線勾配を使用する C18 逆相カラムでクロマトグラフィーによって分離されました。 MS および MS/MS データは、IDA、陽イオン モードを使用して収集されました。 LC-MS 生データは、SCIEX BioPharmaView ソフトウェアを使用して処理されました。 ペプチドを同定するために次の基準が使用されました: 一致する前駆体の質量精度は質量誤差の 5 ppm 以内でなければならず、ペプチド同定ではペプチド マッチング スコアは少なくとも 3 に設定されました。

MetECD (60 nM) および Fc(aMD4)B1/B2/B3 (20 nM) を、0.01% Triton X-100 を含む 100 μl PBS 中で 1 時間混合しました。 サンプルを 2 つに分けて 1 mM BS3 (Thermo Fisher) で処理するか、未処理で 1 時間放置し、50 mM Tris でクエンチし、SDS-PAGE (7.5% または 3-10% ゲル) を行って銀染色しました。 HS-AFM 観察では、MetECD (2.6 μM) と Fc(aMD4)B3 (1.3 μM) を 0.01% Triton X-100 を含む 100 μl PBS で 1 時間混合し、1 mM BS3 で 1 時間処理し、 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓを使用し、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ）上のサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。 分離した画分を SDS-PAGE で分析し、クーマシー ブリリアント ブルーで染色しました。 単一の画分を HS-AFM 分析に供しました。

HS-AFM 測定はタッピング モードで実行されました。 カンチレバーのたわみは、赤外線 (IR) レーザー (0.7 mW、780 nm) を使用する光ビームたわみ検出器で検出されました。 IR レーザー ビームは、×60 対物レンズ (CFI S Plan Fluor ELWD ×60、Nikon) を通して、金膜で覆われたカンチレバー (オリンパス、BL-AC10DS-A2) の裏側に焦点を合わせました。 カンチレバーからの IR レーザーの反射は、2 セグメントの PIN フォトダイオード (MPR-1; Graviton) を使用して検出されました。 HS-AFM のフィードバック制御では、自由振動振幅は約 1 nm、設定値振幅は自由振幅の約 90% でした。 AFMプローブには、電子ビーム蒸着法で成長させた長さ約500nmのアモルファスカーボンチップを使用した。 AFM基板には0.01%の3-アミノプロピルトリエトキシシラン（信越シリコーン）で表面処理したマイカを使用した。 すべての HS-AFM 観察は、50 mM Tris-HCl (pH 7.4) および 100 mM NaCl を含む緩衝液中で室温で実行されました。

ヒト化肝臓を有するキメラマウスに由来する初代ヒト肝細胞の単層をPhoenixBioから入手し、コラーゲンでコーティングした12ウェルプレートで増殖させた。 肝細胞は、10% FBS、20 mM HEPES、44 mM NaHCO3、抗生物質（100 U ml-1 ペニシリン G および 100 μg ml-1 ストレプトマイシン）、15 μg ml-1 を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）からなる dHCGM 培地で培養しました。 1 l-プロリン、0.25 μg ml-1 インスリン、50 nM デキサメタゾン、5 ng ml-1 上皮成長因子、0.1 mM l-アスコルビン酸、および 2% ジメチルスルホキシド (すべて PhoenixBio のサプリメント)。

凍結保存されたヒト肝細胞は Gibco から入手しました。 細胞を超低付着性 96 ウェル プレート (Nunclon Sphera、Thermo Fisher) に 1 ウェルあたり生細胞 1,500 個で播種し、その後 200 × g で 2 分間遠心分離しました。 細胞を、2 mM GlutaMAX、100 U ml-1 ペニシリン、100 μg ml-1 ストレプトマイシン、4 μg ml-1 インスリン、1 μM デキサメタゾン、15 mM HEPES (pH 7.4) および 10% を添加した 100 μl Williams E 培地に播種しました。 FBS（すべてオリエンタル酵母のサプリメント）。 播種後 5 日後、スフェロイドが十分にコンパクトになった時点から、培地の 50% を 2 mM GlutaMAX、100 U ml-1 ペニシリン、100 μg ml-1 ストレプトマイシン、 6.25 μg ml-1 インスリン、6.25 μg ml-1 トランスフェリン、6.25 μg ml-1 亜セレン酸、1.25 mg ml-1 BSA、5.35 μg ml-1 リノール酸、100 nM デキサメタゾンおよび 15 mM HEPES (pH 7.4) (すべて東洋酵母のサプリメント）。 7 日目と 9 日目に、0.3 nM HGF または 30 nM Fc(aMD4)B3 を含む無血清培地でスフェロイドを処理しました。各グループにつき 48 個のスフェロイドを収集し、8 日目または 10 日目に RNA 単離に供しました。

単層肝細胞を、0.2% BSA を含む DMEM 中で 3 時間血清飢餓状態にし、HGF (0.01 ～ 1 nM)、Fc(aMD4)B3 (1 ～ 100 nM)、Fc (100 nM) で刺激するか、非刺激 (なし) で DMEM 中で刺激しました。 10％血清を10分間。 EHMES-1 細胞を、0.2% BSA を含む RPMI1640 中で 3 時間血清飢餓状態にし、HGF (0.04 ～ 1.1 nM)、Fc(aMD4)B3 (1.3 ～ 33 nM) で刺激するか、0.2% BSA を含む RPMI1640 中で 10 分間刺激しませんでした。 これらの細胞を氷冷した PBS で洗浄し、400 μl の溶解バッファー (50 mM Tris、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1% NP-40、10% グリセロール、1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド、1 mM Na3VO4、1 mM NaF、1 mM エチレンジアミン四酢酸およびプロテアーゼ阻害剤)。 溶解物を 27G 針と 0.45 µm フィルターに通し、遠心分離しました。 溶解物のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイ (Thermo Fisher) によって測定されました。 上清を、リン酸化された Erk1/2 (T202/Y204) (1:1,000 希釈、D13.14.4E、Cell Signaling Technology)、Erk1/2 (1:1,000 希釈、137F5、Cell Signaling Technology)、リン酸化された Erk1/2 (T202/Y204) についてウェスタンブロッティングに供しました。 Akt (S473) (1:1,000 希釈、D9E、Cell Signaling Technology)、Akt (1:1,000 希釈、11E7、Cell Signaling Technology)、または GAPDH (1:1,000 希釈、14C10、Cell Signaling Technology)。 上清を抗 Met 抗体 (600 μl 溶解物に対して 5 μg、D-4、Santa Cruz Biotechnology) を用いた免疫沈降と、Met (1:1,000 希釈、D1C2、Cell Signaling Technology)、リン酸化 Met (Y1234) のウェスタンブロッティングに供しました。 /Y1235) (1:1,000 希釈、D26、Cell Signaling Technology)、リン酸化 Met (Y1003) (1:1,000 希釈、13D11、Cell Signaling Technology) またはリン酸化 Met (Y1349) (1:1,000 希釈、130H2、Cell Signaling Technology) ）。 ブロッティングの後に、HRP結合二次抗体（Dako）を使用し、イメージリーダーFUSION-SOLO.6S.EDGE（VIRVER）を使用してImmunoStar LD試薬（Wako）で発色した化学発光を測定しました。 ホスホ-RTK アレイの場合、肝細胞を 0.2% BSA を含む DMEM 中で 3 時間血清飢餓にし、HGF (1 nM)、Fc(aMD4)B3 (100 nM)、DMEM で 10% 希釈した Fc (100 nM) で刺激しました。血清を10分間洗浄し、氷冷PBSで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク）を含む溶解バッファー17（R&D Systems）400μl中で溶解し、0.45μmフィルターに通して遠心分離した。 溶解物 (1 mg) を、Human Phospho-RTK Array キット (R&D Systems) を使用して分析しました。

PXB マウスの肝細胞スフェロイドまたは RNAlater (Thermo Fisher) で処理した肝臓の全 RNA を、QIAzol 溶解試薬 (Qiagen) を使用して調製し、RNA の品質管理と DNBSEQ での RNA-seq のために Bioengineering Lab (神奈川、日本) に送りました。 -G400 シーケンサー (MGI Tech)。 RNA-seq 用の相補 DNA ライブラリーは、MGIEasy RNA 方向性ライブラリー準備セット (MGI Tech) を使用して調製し、AATI フラグメント アナライザー (Advanced Analytical Technologies) を使用して評価しました。 cDNA ライブラリーは、MGIEasy 環状化キット (MGI Tech) を使用して環状化し、DNBSEQ-G400RS ハイスループット シーケンシング キット (MGI Tech) によって DNA ナノボールとして調製し、続いて DNBSEQ-G400 で超並列シーケンス (2×100 bp) を行いました。シーケンサー（MGI Tech）。 Cutadapt (ver. 1.9.1) を使用してアダプター配列を除外し、sickle (ver 1.33) を使用して低品質スコア (<20) または 40 ヌクレオチド未満の配列を除外した後、リードを参照ヒトゲノム (GRCh38.p13) にアライメントしました。 hisat2 ソフトウェア (v2.2.0)。 アライメントデータは、featureCounts (ver. 2.0.0) を使用してカウントされました。 転写物の存在量は、100 万マッピングされたリードあたりのエクソン (RPKM) および 100 万あたりの転写産物 (TPM) のキロベースあたりのリードで測定されました。 DEG 分析は、TCC (v1.18.0) および DESeq (v1.30.0) の DEGES を使用して実行されました (FDR < 0.05 または <0.01、Benjamini-Hochberg、両側)。 特定されたすべての DEG は、Gene Cluster 3.0 を使用したクラスター分析の対象となりました。 PANTHER による GO Enrichment Analysis を使用して、大幅に強化された GO 用語が特定されました。

Fc 0.7 mg kg-1 を尾静脈に単回注射した野生型 C57BL/6 マウス（雌、9 週齢、18 ～ 21 g、日本 SLC から入手）で、最大 9 時間の血清中半減期を測定しました。 、Ｆｃ（ａＭＤ４）Ｂ３については０．７４ｍｇ ｋｇ−１、ヒト組換えＨＧＦ（Ｋｒｉｎｇｌｅ Ｐｈａｒｍａ）については１．０ｍｇ ｋｇ−１、１００μｌのＰＢＳで希釈した。 mFcRn-/- マウスと hFcRn Tg 276 ホモ接合体を交配させることによって社内で作製された mFcRn-/- hFcRn Tg 276 ヘテロ接合体マウス（雌、9 ～ 12 週、18 ～ 24 g）で、最大 12 日の血清中半減期を測定しました。マウスはジャクソン研究所から入手した。 マウスには、100μl PBSで希釈したFcについては0.7 mg kg-1、またはFc(aMD4)B3については0.74 mg kg-1を単回尾静脈注射した。 尾静脈への単回注射または5.0 mg kgの皮下注射を施したヒト化肝臓キメラマウス（PXBマウス、PhoenixBio、雄、12週以上、19～24 g）においても、最大12日の血清中半減期を測定した。 Fc(aMD4)B3 の場合は -1 (100 µl PBS で希釈)。 アキノキリンソウ動物用ランセット (バイオリサーチセンター) を使用して顎下静脈から、または各時点で眼窩神経叢から血液を採取し、血清に処理して分析まで -80 °C で保存しました。 ＦｃおよびＦｃ（ａＭＤ４）Ｂ３の血清濃度は、ヒト免疫グロブリン認識イムノアッセイ（ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ定量セット、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して測定した。 HGF の血清濃度は、社内で開発された ELISA を使用して測定されました。 すべての動物実験手順は、動物実験の適正な実施に関するガイドライン（2006 年 6 月 1 日、日本学術会議）に従って実施されました。 この手順は、金沢大学の治験審査委員会またはフェニックスバイオの実験動物倫理委員会によって承認されました。

ヒト化肝臓を持つキメラマウス（PXBマウス、PhoenixBio）は、ヒト肝細胞を移植されたウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子cDNA/重度複合免疫不全マウスから作製され、肝細胞の約80％がヒト化されていました48。 PXBマウス（雄、12週以上、15〜21g）に、200μlのPBSまたはコントロールPBS中のFc(aMD4)B3を5mg kg-1で単回皮下注射した。 Fc(aMD4)B3 またはコントロール PBS の投与 44 時間後、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン (BrdU) (Sigma Chemical) をキメラ マウスに 100 mg kg-1 の用量で 2 時間腹腔内注射しました。殺すこと。 PXB マウスから単離した肝臓は、RNA-seq のために RNAlater で処理するか、BrdU 染色のために準備しました。 キメラ肝臓のホルマリン固定パラフィン切片を、3 μg ml-1 のラット抗 BrdU 抗体 (Abcam、ab6326) とインキュベートし、続いて 1 μg ml-1 の Alexa Fluor 488 結合抗ラット IgG ヤギポリクローナル抗体とインキュベートしました。 (アブカム、ab150157)。 核を300nMの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、Thermo Fisher)で対比染色した。 蛍光画像はKeyence BZ-X810を使用して取得しました。 ＢｒｄＵ陽性核の数は、動物１匹当たり、左葉外側葉および右葉内側葉の切片において、ランダムに選択した２０視野の少なくとも１５，０００個の細胞を計数することによって決定した。 ヒト化肝臓組織を含む手順は、PhoenixBio のヒト組織利用倫理委員会によって承認されました。 すべての動物実験手順は、動物実験の適正な実施に関するガイドライン（2006 年 6 月 1 日、日本学術会議）に従って実施されました。 この手順は、PhoenixBio の実験動物倫理委員会によって承認されました。

MaxiSorp プレート (Nunc) を組換えマウス TfR (PBS 中 2 μg ml-1、ウェルあたり 50 μl、R&D Systems) で 4 °C で一晩コーティングし、PBS 中の 0.05% Tween 20 で洗浄し、PBS 中の 1% BSA でブロックしました。 。 プレートを、PBS中の0.05% Tween 20および1% BSAで希釈したdTfR(aMD4)、sTfR(aMD4)またはFc(aMD4)の1:3連続滴定とともに室温で1時間インキュベートし、0.05% Tween 20で洗浄した。 PBS、HRP結合抗ヒトIgG Fc抗体（0.5μg ml-1、ウェルあたり100μl、Bether Laboratories）とともに室温で1時間インキュベートし、PBS中の0.05％Tween 20で洗浄した。 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン基質(Cell Signaling Technology)とのインキュベーションによってシグナルを生成し、ARVO MXプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して吸光度を読み取った。

野生型 C57BL/6 マウス（雌、生後 7 ～ 8 週、17 ～ 20 g、SLC から入手）に、1 kg あたり等モル量を尾静脈に 1 回注射しました。dTfR(aMD4) については 26.5 mg kg-1、20.0 sTfR(aMD4) の場合は mg kg-1、Fc(aMD4) の場合は 12.0 mg kg-1、200 μl PBS で希釈。 注射の 24 時間後、マウスに麻酔をかけ、右心室から血液を採取し、血清に処理しました。 ２ｍｌ／分の速度で８分間ＰＢＳを灌流した後、マウスから脳を単離した。 脳の各半分を、CompleteMini EDTA フリー プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤 (Roche Diagnostics) を含む PBS 中の 1% NP-40 (Calbiochem) でホモジナイズし、4 °C で 1 時間回転し、14,000 rpm で 20 分間回転させ、上清を回収した。 血清および脳ライセートについて、ヒト免疫グロブリン認識免疫測定法（ヒトIgG ELISA定量セット、ベチルラボラトリーズ）を用いた抗体測定を行った。 脳内の濃度を計算するために、ng g-1 脳を ng ml-1 とみなしました。 脳の各半分を最適切断温度化合物（サクラファインテックジャパン）に包埋し、液体窒素中で凍結させ、厚さ10μmで切片化した。 4% パラホルムアルデヒドを含む PBS で 30 分間固定した後、切片を 5% BSA、0.3% Triton X-100 を含む PBS でブロックし、ヤギ抗ヒト IgG Fc 抗体 (1:500 希釈、Betic Laboratories) で染色しました。マウス抗マウスNeuN抗体（1：500希釈、Millipore）、マウス抗GFAP抗体（1：500希釈、GA5、Cell Signaling Technologies）またはマウス抗Iba1抗体（1：500希釈、GT10312、GeneTex） ) 1% BSA および 0.1% Triton X-100 の PBS 溶液で 4 °C で一晩培養しました。 抗ヒト IgG Fc および抗 NeuN を、それぞれ Alexa Fluor 488 結合抗ヤギ二次抗体または Alexa Fluor 594 結合抗マウス二次抗体 (1:200 希釈、Thermo Fisher) で視覚化しました。 皮質領域の蛍光画像は Keyence BZ-X810 で取得しました。 この研究は金沢大学の治験審査委員会によって承認され、ガイドラインおよび規則に従って実施されました。

グラフ作成と統計分析には、Graphpad Prism 6.0d を使用しました。 個々の実験に関連する統計手法については、図の凡例で詳しく説明します。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究結果を裏付ける主なデータは、記事とその補足情報で入手できます。 RNA-seq データは、DDBJ Sequence Read Archive でアクセッション番号 DRA014557 (肝細胞スフェロイド) および DRA014558 (PXB マウスの肝臓) で入手できます。 研究中に生成された生データは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。 図のソース データはこのペーパーに付属しています。

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この研究は、世界プレミア国際研究センターイニシアチブ (WPI)、文部科学省、日本の支援を受けました。 日本学術振興会科学研究費補助金 (C) (20K06553) KS へ。 日本学術振興会科学研究費補助金基盤研究（B）（19H03499）および挑戦的研究（21K18250）をKMに贈呈。 日本医療研究開発機構 (AMED) から KS への肝炎基礎・臨床研究プログラム (JP21fk0210087)。 AMED創薬・ライフサイエンス研究支援プラットフォーム事業（革新的創薬・ライフサイエンス研究支援基盤）をHS（JP19am0101090）、JT（JP19am0101075）に採択。 および日本学術振興会科学研究費補助金基盤研究(B) (21H01771) を修士に授与されました。この研究は、大阪大学タンパク質研究所の共同研究プログラム (CR15-05) および大阪大学からの学外共同研究助成金の下で実施されました。がん研究所（金沢大学） 英語レビューをしていただいたドルフィン株式会社に感謝いたします。

金沢大学癌研究所腫瘍動態制御部門

Katsuya Sakai, Nichole Marcela Rojas-Chaverra, Hiroki Sato, Ryu Imamura, Itsuki Sakai & Kunio Matsumoto

WPI-ナノ生命科学研究所 (WPI-NanoLSI)、金沢大学、金沢市

Katsuya Sakai, Ryu Imamura, Mikihiro Shibata & Kunio Matsumoto

大阪大学タンパク質研究所タンパク質合成発現研究室

Nozomi Sugano-Nakamura, Emiko Mihara, Sayako Watanabe & Junichi Takagi

金沢大学フロンティア科学研究拠点 腫瘍微小環境研究ユニット（金沢市）

Hiroki Sato & Kunio Matsumoto

金沢大学癌研究所炎症・上皮可塑性ユニット

ドミニク・チーチェン・ブーン

金沢大学フロンティア科学研究拠点 がんモデル研究革新ユニット（金沢市）

ドミニク・チーチェン・ブーン

フェニックスバイオ株式会社 研究開発部（東広島市）

Chihiro Yamasaki & Chise Tateno

金沢大学新領域創成科学研究機構 生物学応用高速AFMユニット

Mikihiro Shibata

東京大学大学院理学系研究科化学専攻

Hiroaki Suga

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KS、H. Suga、JT、KM がこの研究を考案し、設計しました。 KS は、タンパク質の発現と精製、細胞アッセイ、FcRn の SPR、架橋、RNA-seq、血清半減期実験、および mTfR 結合アッセイを実施しました。 NS-N。 Metに対してフローサイトメトリーとSPRを実施しました。 EM は、Fc 移植片とその活性の予備評価を実施しました。 SW はタンパク質の発現と精製、およびキメラ Met 実験による結合部位のマッピングを実行しました。 NMR-C。 BBB透過実験を行った。 IS は DS バリアントを実行しました。 佐藤博司は免疫組織化学を実施し、動物実験に貢献した。 RIは動物実験に貢献しました。 DC-CV は動物実験に貢献し、原稿を批判的に改訂しました。 CY および CT は、PXB マウスで BrdU 標識を実行しました。 MS は HS-AFM を実行しました。 原稿は KS によって書かれました。著者全員が結果について議論し、原稿についてコメントしました。

Correspondence to Katsuya Sakai, Junichi Takagi or Kunio Matsumoto.

H. Suga と JT は MiraBiologics Inc. の共同創設者であり株主です。EM、KS および KM も同じ会社の株主です。 他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Biomedical Engineering は、この研究の査読に貢献した Richard Siegel、Birgit Schoeberl、Manuel Sanchez-Felix および他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

対照FcまたはFc変異体を発現するExpi293F懸濁培養の馴化培地を、プロテインAビーズを使用してプルダウンし、非還元条件下でSDS-PAGEによって分析し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。 Fc(aMD4) の画像は、以前のレポートから転載したものです27。

表面プラズモン共鳴によって測定された、Fc または Fc(aMD4) のヒト MetECD への結合センサーグラム。 測定された曲線は赤色で表示されます。 近似された曲線は黒で表示されます。 RU、共鳴単位。 SPR、表面プラズモン共鳴。

a、HGFまたはFc(aMD4)B3で10分間処理したEHMES-1細胞におけるMetチロシン残基のリン酸化レベル。 溶解物をウェスタンブロッティングによって分析した。 ｂｃ、ＥＨＭＥＳ－１細胞をＨＧＦ（ｂ）またはＦｃ（ａＭＤ４）Ｂ３（ｃ）で処理した。 刺激後の各時点での Met、Akt、または Erk1/2 の活性化を、抗リン酸化 Met (Tyr1234/1235)、抗リン酸化 Akt (S473)、または抗リン酸化 Erk1/2 (T202/Y204) を用いて in situ で定量しました。 ）抗体、それぞれ。 結果は、非刺激対照と比較した誘導倍数の平均±SEMとして示されます(n = 4、独立した実験)。

ソースデータ

ａ、Ｆｃ（ａＭＤ４）Ｂ３と、ヒトＭｅｔＥＣＤ、マウスＭｅｔＥＣＤ、またはヒトとマウスを可変的に融合させたキメラＭｅｔＥＣＤとの間の関連を、プルダウンアッセイによって評価した。 PAタグ付きMetECDは、抗PAタグ抗体結合ビーズを使用して沈殿させました。 aMD4ペプチドはヒトMetECD40には結合するがマウスMetECD40には結合しないという我々の以前の報告と一致し、Fc(aMD4)B3はヒトMetECD(hWT)には結合するがマウスMetECD(mWT)には結合しない。 PSI ドメインと IPT ドメインをマウス配列 (変異体 A ～ E) に置換すると、Fc(aMD4)B3 への結合が保存され、PSI ドメインと IPT ドメインが Fc(aMD4)B3 結合に不要であることが示されました。 対照的に、Sema ドメインのブレード 5 ～ 7 のヒト特異的残基は、Fc(aMD4)B3 結合に必要でした (バリアント F)。 Sema ドメイン内の番号は各ブレードを示します。 b、ブレード6のヒト特異的残基(dのB6-1およびB6-2)は、Fc(aMD4)B3結合に不可欠であった。 c、ブレード5のヒト特異的残基(dのB5-1およびB5-2)も、それぞれFc(aMD4)B3結合に必須または寄与していた。 d、ヒトおよびマウスのMet Semaドメインのアミノ酸配列アラインメント。 ヒトとマウスの間で異なる残基は太字で示されています。 赤いバー (B5-1、B6-1、および B6-2) は、Fc(aMD4)B3 結合に不可欠な残基を示します。 オレンジ色のバー (B5-2) は、Fc(aMD4)B3 結合に寄与する残基を示します。

a、SDS-PAGEにより分析された分子量は、MetECDとFc(aMD4)B3の2:1および1:1複合体を示した。 SDS-PAGE 分析は、7.5% ゲル (青色、図 3b) および 3 ～ 10% ゲル (オレンジ色、図 3b) を使用して実行されました。 b、インビトロでのFc(aMD4)によるMet二量体形成のSDS-PAGE分析。 MetECDとFc(aMD4)または対照Fcとの間の複合体をBS3により架橋し、非還元条件下でSDS-PAGE(3〜10%ゲル)および銀染色により分析した。 c、MetECDおよびFc(aMD4)B3をBS3によって架橋し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に供した。 クーマシー ブリリアント ブルー染色による SEC 画分の非還元 SDS-PAGE の結果を示します。 図3e、fに示すように、赤色で示した画分をHS-AFMに供しました。

ソースデータ

a、pH 6.0および7.4におけるFcのFcRn/β2 Mへの結合センサーグラム。 お尻、FCの追加; ディス、バッファウォッシュ。 b、pH 6.0でのFcまたはFc(aMD4)のFcRn/β2Mへの結合センサーグラム。 センサーグラムは、3 つの濃度の分析物 (250、500、1,000 nM) の複製を示します。 RU、共鳴単位。 SPR、表面プラズモン共鳴。

補足図。

Fc(aMD4)B3 の HS-AFM 分析。

MetECD の HS-AFM 分析。

IPTストークドメインが吹き飛ばされたMetECDとFc(aMD4)B3の2:1複合体のHS-AFM分析。

IPTストークドメインが結合したMetECDとFc(aMD4)B3の2:1複合体のHS-AFM分析。

補足図3のソースデータ。

補足図6のソースデータ。

ソースデータ。

ソースデータ。

ソースデータ。

ソースデータ。

ソースデータ。

ソースデータ。

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転載と許可

酒井和也、菅野・中村直人、三原英治 他大環状ペプチドをフラグメントの結晶化可能な領域にグラフトすることにより、薬物動態が強化された受容体アゴニストを設計します。 ナット。 バイオメッド。 Eng 7、164–176 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41551-022-00955-6

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受信日: 2021 年 10 月 22 日

受理日: 2022 年 9 月 26 日

公開日: 2022 年 11 月 7 日

発行日：2023年2月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00955-6

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ネイチャー生体医工学 (2022)