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Jan 05, 2024

分子運命

Natura Volume 615, pagine

Nature volume 615、pages 482–489 (2023)この記事を引用

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295 オルトメトリック

メトリクスの詳細

血清抗体の保護効果は、異なる親和性と特異性を持つ抗原特異的な B 細胞クローンの相互作用によって生じます。 これらの細胞動態は、原抗原性罪（OAS）などの血清レベルの現象の根底にあります。これは、関連する抗原に遭遇したときに、抗原性刺激に関与する B 細胞の最初のコホートに繰り返し依存する免疫系の傾向であり、抗原性罪の誘導に有害であると考えられています。新しい反応1、2、3、4、5。 新しいバリアント特異的抗体の OAS 型抑制は、インフルエンザや SARS-CoV-26,7 などの急速に進化するウイルスに対するワクチン接種の障壁となる可能性があります。 OAS 型抑制の正確な測定は、細胞および時間的起源を循環中の抗体に容易に帰すことができないため、困難です。 したがって、その後の抗体応答に対するその影響は不明のままです5,8。 ここでは、B 細胞の特定のコホートに由来する血清抗体を区別して検出できる分子運命マッピング アプローチを紹介します。 我々は、逐次相同追加免疫に対する血清応答は圧倒的に初代コホートB細胞に由来するが、その後のナイーブB細胞からの新たな抗体応答の誘導は強く抑制されることを示す。 このような「一次中毒」は抗原距離の関数として急激に減少し、多様なウイルス糖タンパク質による再免疫化により、初回刺激変異体に存在しないエピトープを標的とする新たな抗体応答が生じることが可能となる。 私たちの発見は、OAS の理解と、進化する病原体に対するワクチンの設計と試験に影響を及ぼします。

感染を防御する血清抗体の能力は、さまざまな特異性およびさまざまな親和性を持つ B 細胞クローンによって時間の経過とともに分泌される免疫グロブリンの複雑な混合物の新たな特性です。 これらの抗体を産生する形質細胞は、一次感染または免疫後のナイーブB細胞前駆体からの直接分化から、胚中心（GC）での1回以上の親和性成熟およびメモリーB細胞相のインターカレーションを含む複雑な経路に至るまで、複数の並行経路を介して発生します。 。 これらの細胞経路の複雑さは、抗原曝露を繰り返すと著しく増大し9、10、11、12、血清抗体プールへの最終的な寄与をデコンボリューションすることは困難でした。 一方で、記憶細胞または GC B 細胞から得られた免疫グロブリン遺伝子の分子分析では、血清中の抗体の組成を直接評価することはできません 13、14、15、16。 一方、血清抗体のクローン組成を直接研究しても、異なる特異性の抗体に細胞起源または時間起源を容易に割り当てることはできません 17,18。 したがって、血清レベルで起こる免疫現象のクローン動態はまだほとんど理解されていません。

解明が特に困難な血清レベルの現象は OAS であり、特定のインフルエンザ株に曝露された個人が、初期に出会った最初のインフルエンザ株に対してより強く反応する抗体で反応する傾向として 1950 年代に説明されました。曝露ストレスそのものよりも、幼少期の影響が大きい1,19。 OAS はもともと、抗原に応答する B 細胞の最初のコホートを繰り返し再利用する免疫系の傾向に起因すると考えられており、その反応性は必然的に最初にそれを引き起こした菌株に偏ることになります。 しかし、抗原性の年功性 4,20 などの関連概念とは対照的に、OAS (本明細書で定義) は追加免疫後のナイーブ レパートリーからの新しい B 細胞クローンの新規補充を積極的に抑制する必要がある 2,3,4。免疫システムは、エピトープを回避するために特定の抗体応答を開始します。 この積極的な抑制がどの程度存在し、その後の反応に影響を与えるかについては、数十年にわたって議論されてきました5、8。 より最近では、マウスでの B 細胞運命マッピング実験により、OAS の予測とは明らかに対照的に、追加免疫に応答して形成される GC は、記憶由来ではなくほぼナイーブ B 細胞のみで構成されていることが示されました 21,22,23。 この後の追加は、マウスにおける OAS の影響が無視できるか、または OAS が血清レベルのみで観察される現象であることを意味します。

この問題を解決するには、繰り返しの抗原曝露に対する応答に対する OAS の影響を一般的に理解するには、そのような細胞運命マッピング実験を血清抗体自体に置き換える能力が必要となります。 これを達成するために、我々は古典的な運命マッピング戦略を採用して、血清中の抗体の細胞的および時間的起源の検出を可能にしました。これを分子運命マッピングと呼んでいます。 我々は、免疫グロブリンカッパ（Igκ）軽鎖遺伝子（Igk）のC末端を延長して、LoxPに隣接するFlagタグ、その後に下流のStrepタグをコードするようにマウスを操作しました（図1aおよび拡張データ図1）。 この「Κ タグ」対立遺伝子を持つ B 細胞は、Cre リコンビナーゼに曝露されない限り、Flag タグ付きの免疫グロブリンを産生し、その後、Flag タグを Strep タグに永久的に切り替えます。 したがって、Cre媒介組換えは、これらのB細胞およびその形質細胞子孫がその表面で発現する、および/または血清中に分泌する抗体の運命地図を作成します。 これにより、各タグに特異的な二次試薬を使用した、運命マッピング前および後の Igκ+ 抗体の差動検出が可能になります。

a、Cre媒介組換え前後のIgkTag（Kタグ）対立遺伝子の概略図。 UTR、未翻訳領域。 b、示された遺伝子型のマウスにおけるFlagタグおよびStrepタグ付きB細胞受容体の発現を示す血液B細胞のフローサイトメトリー分析。 c、Igκ軽鎖またはFlag/Strepタグについて染色された、示された遺伝子型のマウスから得られた血清のウェスタンブロット分析。 2 つの実験の代表。 d、GC B細胞とその抗体産生の運命をマッピングするために使用される免疫化戦略の概略図。 e、ミョウバンアジュバント中のTNP-KLHによる足蹠免疫化の12日後の膝窩リンパ節のフローサイトメトリー分析。 B 細胞 (B220+CD4-CD8-CD138-) を GC (Fas+CD38-) および濾胞 (Fo) B 細胞 (Fas-CD38+) マーカーについて染色しました。 f、eのデータの定量化。 各点は個々のリンパ節を表し、棒は中央値を表します。 g、アルヒドロゲルアジュバント中のTNP-KLHで腹腔内免疫したマウスにおけるTNP4-BSA ELISAによって測定した抗TNP総IgGおよびタグ特異的エンドポイント力価。 細線は個々のマウスを表し、太線は各時点での対数変換された力価値の中央値を結びます。 結果は、2 つの独立した実験からの 9 匹のマウスからのものです。 TMX.、タモキシフェン。 ｈ、捕捉試薬としてＴＮＰ１−ＢＳＡまたはＴＮＰ１３−ＢＳＡを使用するＥＬＩＳＡによって推定された、ｇに示される同じサンプルの抗ＴＮＰ Ｆｌａｇ＋およびＳｔｒｅｐ＋抗体の相対親和性。 データは、対数変換された力価値の平均±標準誤差である。 抗TNP1-BSA力価と抗TNP13-BSA力価の間の比率をサンプルごとに計算し、右側に示します。

Κ タグ対立遺伝子の機能を検証するために、我々はまず、IgkTag マウスの B 細胞がその表面にタグ付き B 細胞受容体を発現していることを確認しました。 対立遺伝子排除のルール 24 に従って、ヘテロ接合型 Igk (野生型 (WT)/タグ) またはホモ接合型 IgkTag/タグ マウスを発現するマウスの B 細胞の約 50% および 95% が Flag+ でした (予想どおり、ホモ接合型の B 細胞の約 5%マウスは Igλ 軽鎖を保有していました 24; 拡張データ図 2a)。 すべてのB細胞がCreリコンビナーゼ（IgkTag/TagCd79aCre/+）を構成的に発現したΚタグマウスは、ほぼすべてのIgκ+ B細胞でFlagをStrepタグに置き換えました（図1b）。 重要なことに、Kタグマウスは、定常状態の血清抗体レベルに影響を与えることなく、Creリコンビナーゼの非存在下または存在下でそれぞれFlagまたはStrepタグ付き抗体を血清中に適切に分泌しました（図1c）（拡張データ図2b）。 IgkWT/Tag マウスにおけるタグ付き循環 B 細胞とタグなし循環 B 細胞の割合が等しいことで示されるように、Κ タグ B 細胞の生成と成熟は損なわれませんでした (図 1b)。 同じことが、IgkFlag / Strepmice で Flag タグと Strep タグを発現する循環 B 細胞および骨髄形質細胞にも当てはまり、2 つの Κ タグ対立遺伝子のうちの 1 つが生殖系列における Cre 発現によって事前に組み換えられていました（図 1b および拡張データ図2c)。

Flag+ および Strep+ B 細胞が B 細胞活性化、親和性成熟、および形質細胞分化の過程を通じて同等に競合することを確認するために、IgkFlag/Strep マウスをモデル抗原 2,4,6-トリニトロフェニル-キーホール リンペット ヘモシアニン ( TNP-KLH) をミョウバンアジュバントに溶解し、各タグを持つ抗体の血清力価を経時的に追跡しました。 各タグを持つ抗TNP抗体の力価を直接比較できるようにするために、二次（抗Flagまたは抗Strep）抗体を希釈して、組換えFlagまたはStrepタグ付きモノクローナル抗体を使用して生成された標準曲線の同様の検出を達成しました（拡張データ）図2d)。 これらの曲線を使用して正規化されたエンドポイント酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）力価は、Flag+画分とStrep+画分の間で同様の範囲の抗TNP反応性を示し（拡張データ図2e）、異なるタグが付けられたB細胞の同等の競合性を示しました。

免疫応答のさまざまな段階で関与する B 細胞によって産生される血清抗体に続いて、活性化された B 細胞クローンの一時的に制限された運命マッピングが必要です。 これを可能にするために、我々は、IgkTag マウスを GC 特異的、タモキシフェン誘導性 S1pr2-creERT2 BAC トランスジェニック対立遺伝子 25​​ と交配しました (S1pr2-IgkTag マウスを生成するため)。 TNP-KLH 免疫後 4 日目と 8 日目にマウスをタモキシフェンで治療すると、GC B 細胞では Κ タグ対立遺伝子の効率的な組換え (96.1 ± 0.50% (平均 ± sem) ((Strep+/Tag+) × 100)) が起こりましたが、そうではありませんでした。免疫化後 12 日目（dpi）の同じリンパ節の非 GC B 細胞における（図 1d–f）。 再び、ヘテロ接合性 S1pr2-IgkWT/Tag マウスでは、タグ付き B 細胞がタグなしの B 細胞と同様の割合で見つかりました (平均 41 ± 9.0% (平均 ± sd) Tag+)。これは、タグの発現がマウスにおける B 細胞の競合性を損なわないことを示しています。 GC (拡張データ図 2f、g)。 タモキシフェンで処理されていないCre-動物（図1f）またはS1pr2-IgkWT/TagマウスのGC B細胞はFlag+のままであり、後者では最小限の自発的組換え（12dpiで1.3±1.0％（平均±sd）Strep+）のみでした。 (拡張データ図 2g)。

アルヒドロゲル中のTNP-KLHで腹腔内(ip)免疫し、4、8、12日目にタモキシフェンで処置したS1pr2-IgkTagマウスの総抗TNP IgG抗体は、8 dpiで血清中に最初に検出され、60 dpiまで徐々に増加した(図1) .1g）。 GC 由来 (Strep+) 抗体と非 GC 由来 (Flag+) 抗体のデコンボリューションにより、8 dpi でピークに達した濾胞外 Flag+ 抗体の初期波が、14 dpi で血清中に最初に検出された GC 由来 Strep+ 抗体によって徐々に置き換えられることが示されました。 (図1g)。 Flag+ 抗 TNP 抗体は、卵胞外起源から予想されるように、47 ～ 60 dpi の間でベースライン近くのレベルまで退縮しました。 親和性依存性抗TNP ELISAは、GC由来Strep+抗体画分においてのみ検出可能な親和性成熟を示し(図1h)、GC由来抗体の効率的な運命マッピングを確認した。 タモキシフェンを投与されなかった対照動物のバックグラウンドシグナルは、一次反応全体を通して検出限界（LOD）未満のままでした（拡張データ図2h）。 したがって、S1pr2-IgkTag マウス モデルを使用すると、免疫化に応答して GC 反応に入った B 細胞の第 1 波に由来する抗体を識別することができます。 我々のデータはまた、これらの環境では濾胞外反応の持続時間が比較的短いこと、および免疫化の最初の数週間後に検出可能なほとんどすべての抗体、特に親和性の高い抗体が GC 起源の形質細胞に由来することを示しています。

このシステムを利用して、我々は、OAS型抑制が相同追加免疫に対する新規抗体反応の発現にどの程度影響を与えるかを測定しようとした（我々は、相同レジメンを包含するために、この抑制を総称して一次依存症と呼ぶ）。 この目的を達成するために、我々は、タモキシフェンを投与することにより、時間分解的に Κ タグ対立遺伝子の Cre 媒介組換えを引き起こす能力を利用して、一次免疫に応答して GC を形成した B 細胞によって産生される血清抗体をマークしました（一次コホート）。 このアプローチでは、一次コホートB細胞の標識に加えて、その後のブースター投与によって新たに結合したクローンから生じた抗体をFlagタグで「逆運命マップ」することもできる。 この特性により、リコール抗体応答の 2 つのモデルを区別することができます: (1) 単純な逐次寄与モデル。このモデルでは、新規応答は、記憶由来のものより小さいにもかかわらず、同様の反応速度で新しい一次応答に進行することができます。 、提供される抗原の用量が増えるにつれて加算されます（抗原の年功に関連します）。 （2）一次中毒モデル（OASに関連）。このモデルでは、一次反応は、数回の追加免疫後であっても、その後の新規抗体反応の出現を積極的に抑制します（図2a）。

a、抗原インプリンティングの逐次寄与および一次中毒モデルの概略図。 b. 一次中毒を測定するために使用される一般的な予防接種戦略。 S1pr2-IgkTag/Tag マウスは、黒い矢印で示された日にミョウバン中の TNP-KLH (c、d) または WH1 mRNA-LNP (e-g) で免疫化し、 に示すように 4、8、および 12 dpi でタモキシフェンで処理しました。赤い矢印。 c、ELISAによりTNP4-BSAを使用して測定した抗TNP血清IgG（左）、Igκ（中央）およびタグ特異的力価（右）。 結果は、2 つの独立した実験からの 4 匹のマウスからのものです。 細線は個々のマウスを表し、太線は各時点での対数変換された力価値の中央値を結びます。 d. B 細胞の主要コホートに由来する TNP 力価のパーセンテージ (一次中毒指数) は、各サンプルの Strep+ 力価をその総力価 (Strep+ + Flag+) で割って 100 (S/( S+F）×100）。 e、ELISAで測定した抗WH1 RBD IgG（左）、Igκ（中央）およびタグ特異的力価（右）。 結果は 3 つの独立した実験からの 12 匹のマウスからのものです。 f、一次中毒指数は、dに記載されているように計算されました。 g、一次免疫の有無におけるde novo Flag+抗体応答の比較。 WWW、WH1 S mRNA を 3 回投与。 ØWW、初回投与量と運命マッピングは省略。 WWW データは e と同じサンプルのもので、ØWW と同じアッセイで再測定されます。 h、eに示すコホートの1つについて、前回の投与から133日後にmRNA-LNPの4回目の投与を受けたマウスにおける4次抗WH1 RBD応答（左）および一次中毒指数（右）。 5 匹のマウスのうち 2 匹は 0 日目にサンプリングされませんでした。

ミョウバンアジュバント添加TNP-KLHでS1pr2-IgkTagマウスの腹腔内をプライミングし、タモキシフェンを4、8、および12 dpiで投与して、一次コホートGC B細胞とその記憶および形質細胞子孫の運命地図を作成しました（図2b）。 この設定では、すべての一次コホート由来の抗体は Strep+ ですが、二次または高次のブースティング (記憶または形質細胞の子孫によるものを含む) によって新たに増殖した B 細胞クローンによって産生された抗体はすべて、Flag+ として逆運命マッピングされます。 。 重要なのは、一次抗体と二次以降の抗体を区別するために抗原変異体の違いに依存していないため、このアプローチにより、ゼロ抗原距離、つまりまったく同じ抗原で初回刺激と追加免疫を行った場合の一次中毒を測定できるようになります。 抗原距離が増加するにつれて、de novo 抗体応答の抑制は減少する可能性が高いため 26,27 、このアプローチにより、一次依存症が最も強いときの強度を推定することができます。

初回免疫の 1 か月後および 2 か月後の相同追加免疫により、リコール TNP 力価が予想どおり増加し（図 2c）、ナイーブ由来 B 細胞が優勢なリコール GC が形成されました 21（拡張データ図 3a）。 タグ特異的 ELISA を使用したこれらの応答のデコンボリューションにより、二次力価と三次力価の両方が、一次コホート B 細胞に由来する運命マップされた (Strep+) 抗体によって強く支配されていることが明らかになりました。 Flag+ TNP 特異的抗体も各ブースト後に出現しましたが、その力価ははるかに低いレベルでピークに達し、時間の経過とともに著しく減衰しました (図 2c)。 重要なことに、逐次寄与モデル（図2a）の予想に反して、Flag+記憶B細胞が再活性化されたであろう2回目と3回目の抗原投与の間で、Flag+力価は徐々に増加しませんでした。 両方の測定値を総合するために、Strep+ を Strep+ + Flag+ 力価の合計 (S/(S + F) × 100) で割ることによって計算される「一次依存指数」を作成しました。 これは、ほぼすべての検出可能なリコール抗体（1回目と2回目の追加免疫から14日後の血清反応性の平均95％と97％）が、一次GC反応に関与したB細胞コホートに由来することを示しました（図2d）。 追加免疫後の血清サンプルから IgM を枯渇させると、Flag+ のリコール TNP 力価は急激に低下しましたが、Strep+ のリコール TNP 力価は低下しませんでした。これは、リコールに関与したナイーブ由来の B 細胞が主に濾胞外様 (IgM 主導型) B 細胞応答を生成するという概念を裏付けています (拡張)データ図 3b、c)。

これらの発見を臨床関連の状況に拡張するために、図 2b のようにマウスを免疫化し追加免疫しましたが、融合前安定化 (2P) 型の SARS-CoV をコードする脂質ナノ粒子 (LNP) 配合ヌクレオシド修飾 mRNA ワクチンを使用しました。 2 Wuhan-Hu-1 (WH1) スパイク (S) タンパク質。入手可能な SARS-CoV-2 mRNA ワクチンと同様 28。 二次および三次抗Sタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）抗体も、ほぼ完全に一次コホート（Strep+）B細胞に由来しました（図2e、f）。 GC B細胞と同様に（拡張データ図2g）、タモキシフェンを投与されていない対照マウスの想起反応において、Strep+抗体への低レベルの自発的組換えが検出されました。 これにより、Flag+ 抗体力価がわずかに過小評価されました (2 回目と 3 回目の免疫の 2 週間後、それぞれ中央値 2.1% と 2.8%; 拡張データ図 3d)。 最初の追加免疫後、一次中毒はTNP-KLHよりもSARS-CoV-2 RBDの方が顕著でしたが（この時点では新しい（Flag+）抗体は検出されませんでした）、12匹中5匹のマウスは低いが安定したFlag+力価を発現しました。 3回目の投与後の抗RBD抗体。 この二峰性は、実験コホートや、追加免疫が初回投与部位の同側で行われたか対側で行われたかとは独立しており（拡張データ図3e）、したがって、高度にオリゴクローナルなリコール応答に固有の確率的変動に起因すると考えられます21。 ブーストに対する新規抗体反応が事前のプライミングによってどの程度抑制されたか（つまり、一次中毒抑制効果の大きさ）を定量化するために、WH1 mRNA-LNP を 3 回投与されたマウスの Flag+ 抗体を比較しました（WWW ) プライミングと運命マッピングのステップが省略された追加のグループ (ØWW)。 最終投与後4週間の時点で、WWWマウスではØWWマウスと比較してFlag+応答が55倍低く（図2g）、これは、刺激を受けた動物における新たなB細胞応答が、投与されていない場合と比較して強力に抑制されていることを示しています。呼び水。 最後に、マウスのサブセットの4回目の免疫（前回の追加免疫から>133日後）でさえ、Strepタグ付き抗体が大半を占めたため（図2hおよび拡張データ図3f）、一次中毒は長く続き、やはり実証できなかった。 Flag+ 抗体力価の漸進的な増加は、単純な逐次寄与モデルによって予測されます (図 2a)。 我々は、抗原距離ゼロで測定した場合、一次中毒は非常に強い可能性があると結論付けました。これは、既存の免疫による新規B細胞応答のOAS型抑制の証拠です。

プライミング抗原とブースティング抗原の間の抗原距離の増加に一次中毒がどのように反応するかを測定するために、我々は歴史的な一連のドリフトインフルエンザウイルス赤血球凝集素（HA）変異体をモデルとして使用しました。 まず、OAS が最初に報告された 2 つの株、A/プエルトリコ/1934/8 (PR8) および A/フォート モンマス/1947/1 (FM1) に基づいたインフルエンザ感染/免疫モデル (図 3a) を使用しました。 1,19 - そのうち HA (HAPR8 および HAFM1) はアミノ酸レベルで 90% の同一性を共有します (図 3b)。 ハプテンおよびmRNA免疫化と同様に、HAPR8に対する一次反応は、感染後8日から16日の間にピークに達する高い濾胞外（Flag+）力価によって特徴付けられ、その後GC由来（Strep+）力価に置き換えられました（図3c）。 感染後 3 か月および 4 か月後に組換え HAPR8 タンパク質を皮下に相同追加免疫すると、最初の追加免疫後に Strep+ HAPR8 結合力価が 1 log 増加し、2 回目の追加免疫後にはそれほど顕著ではありませんでした。 タンパク質免疫化と同様に、総力価に対する非一次 (Flag+) 抗体の寄与は小さく、1 回目と 2 回目の追加免疫の間で徐々に増加しましたが、そのピーク中央値は HA 反応性の約 10% でした (図 3c)。 HAFM1による異種ブーストは、一次Strep+ HAPR8力価のわずかなバックブーストのみを引き起こし、Flag+ HAPR8反応性にはほとんど影響を与えませんでした（図3d）。これは、これらの変異体間の実質的な抗原距離を示しています。 したがって、HAFM1に対する交差反応性一次力価は、PR8感染に対する一次濾胞外反応には完全に存在せず、おそらくHAPR8に対する親和性成熟の副作用として、Strep+抗体画分で約4週間目にのみ出現し始めました（図3d）。 。 異種ブースティングは、これらの交差反応性 (Strep+) 力価を 1 log 近く増加させるだけでなく、重要なことに、HAFM1 に対する全血清反応性の約半分が Flag+ に由来するという点で、ブーストによって誘発された de novo クローンからの実質的な応答も誘導しました。 2回目のブースト後の割合（図3d）。 これらのレベルを、以前の感染の非存在下でHAFM1の2回投与によって達成されたレベルと比較すると、一次中毒は新規反応を3.8倍抑制することが示され（拡張データ図4a）、相同mRNAワクチン接種で達成される55倍の抑制よりもはるかに小さいことが示されました。 (図2g)。 したがって、異種追加免疫は一次中毒を部分的に回避し、一次反応に関与しない変異特異的B細胞クローンの増殖および血清寄与の改善を可能にする。

a、インフルエンザ感染とHAブースト戦略の概略図。 S1pr2-IgkTag/Tagマウスを鼻腔内にPR8インフルエンザに感染させ、示された時点でアルヒドロゲル中のHAPR8またはHAFM1で皮下(sc)追加免疫した。 b. HAPR8 三量体構造のレンダリング (タンパク質データバンク (PDB): 1RU7)。1 つの単量体が青緑色で強調表示され、HAPR8 と HAFM1 の間で分岐するアミノ酸が赤色で強調表示されます。 アミノ酸同一性のパーセンテージを括弧内に示します。 c、HAPR8で相同的に追加免疫したS1pr2-IgkTag/Tagマウスにおける抗HAPR8 Flag+およびStrep+力価（左）および一次中毒指数スコアの定量化（右）。 d、HAFM1で異種追加免疫したマウスにおける抗HAPR8（上）および抗HAFM1（下）ELISA反応性。 タグ特異的力価（左）と一次中毒指数の定量化（右）が示されています。 e. HANC95 と HANC99 または HACA09 の間の相違を b のように色分けします。 HACA09(PDB:3LZG)の構造をモデルとしています。 f、拡張データ図4bに概説されているように、HANY95（相同）または変異体HANC99もしくはHACA09（異種）による最初の追加免疫後に示される、HANY95タンパク質で初回刺激されたマウスにおける抗HAタグ特異的力価。 ブースティング抗原に対する抗体の反応性が表示されます。 最高の血清希釈についてELISAによって測定した全時間経過および3つすべてのHAに対する反応性を拡張データ図4cに示します。 g、2回目の追加接種（3回目の投与）後6日（左）および1か月（右）の追加接種HAの1次中毒指数。 P 値は、両側スチューデント t 検定を使用して計算され、同種ブーストの一次依存指数と各異種ブーストを比較しました。 細線は個々のマウスを表し、太線は各時点での対数変換された力価値の中央値を結びます。 結果はすべて 2 つの独立した実験からのものであり、各グループのマウスの数がグラフに示されています。

より広範囲の抗原距離にわたってこの概念を検証するために、アルヒドロゲルアジュバント中の株A/New York/614/1995 (HANY95)由来の組換えH1でマウスを腹腔内免疫し、次にこれらのマウスをHANY95と相同的またはH1sで異種的に2回追加免疫した。株A/ニューカレドニア/20/1999（HANC99; HANY95と96％のアミノ酸同一性を有するわずかに変動した株）またはパンデミックA/カリフォルニア/07/2009（HACA09; 80％のアミノ酸を有する「抗原シフト」株）由来アイデンティティ、図 3e および拡張データ図 4b)。 一般に、この設定では、相同追加免疫であっても、一次依存症はより弱く、より変動しやすいが、これはおそらく、組換えHAPR8タンパク質によって誘発される全体的に弱い一次反応のためである（拡張データ図4c）。 それにもかかわらず、一次抗原と追加抗原の間の抗原距離が増加するにつれて一次中毒が徐々に減少することが観察されたため、HACA09による追加免疫後、HACA09に対する総血清反応の最大80％がフラグタグ付けされていました（一次中毒の20％に相当）バリアント（図3f、g）。 初回刺激HAと追加刺激HAの類似性に基づく感染実験と免疫実験のプールデータは、抗原距離が増加するにつれて一次中毒が非常に有意に直線的に減少することを示しました（拡張データ図4d）。 我々は、プライミング抗原とブースティング抗原の間の抗原距離の増加が一次中毒に対抗し、したがって新しいバリアント特異的抗体応答の生成を可能にする、と結論付けています。

抗原距離による一次中毒の打破が臨床的に重要である状況は、以前にWH1株の抗原に曝露された個人におけるSARS-CoV-2のオミクロン株に対する反応である。 Kタグシステムを使用して、Omicron BA.1株のSタンパク質をコードするmRNA-LNPによる追加免疫が、WH1-SをコードするmRNA-LNP（WH1 BA.1 株は、完全な S タンパク質ドメインと RBD ドメインにおいて、それぞれ 98% と 92% のアミノ酸同一性を持っています)。 S1pr2-IgkTagマウスの右脚にWH1 mRNA-LNPを初回刺激し、1および2か月後に左脚の遠位にBA.1またはWH1 mRNA-LNPのいずれかを追加してこれらのマウスを追加しました（図4a）。 ブースティングは、両方のグループでWH1およびBA.1 RBDに対する同様の総IgG応答を誘導しました（図4b）。 対照的に、両グループの血清は WH1 偽ウイルスを同等に中和しました 29 が、BA.1 追加免疫血清は BA.1 偽ウイルスに対して平均 15 倍強力であり、異種追加免疫療法と同種追加免疫療法の間に強い質的違いがあることを示しています。 タグ特異的ELISAによるこれらの効果のデコンボリューションにより、一次(Strep+)抗体が両方の設定で強く優勢であり、最初の卵胞外反応後に実質的なFlag+反応がなかったという点で、同種ブースト動物と異種ブースト動物の間で区別できないWH1 RBDに対する反応が明らかになった(図4c、d)。 一次免疫化後にBA.1 RBDに対するStrep +抗体はほとんどまたはまったく観察されませんでしたが、BA.1 RBDに対するStrep +反応性は、追加免疫にどの変異体が使用されたかに関係なく、同等に強かったことを思い出してください（図4c、d）。 この観察は、ヒトにおけるWH1ワクチン接種に対する親和性成熟の結果として、他の株への交差反応性が進化することを記録した以前の報告と一致します30。 しかし重要なことに、異種ブースティングは、WH1株と交差反応性のない、新たにリクルートされた（Flag +）クローンによって生成されたBA.1 RBD力価の顕著な増加をもたらしました。この反応性は、相同的にブーストされたマウスには存在しませんでした（図4c、d） ）。 ピーク時（2回目の追加免疫の2週間後）、Strep+抗体は、異種追加免疫マウス全体の総抗BA.1反応性の平均73％（±19％標準偏差）を占めました（図4d）。 完全長WH1およびBA.1 Sタンパク質に対する反応性をアッセイした場合、BA.1の二重ブースト後の新しい（Flag +）抗体の誘導はさらに顕著でした（図4e）。 以前の WH1 免疫の非存在下で BA.1 を 2 回投与した場合 (ØBB)、WBB (WH1-BA.1-BA.1) グループよりわずか 3.6 倍高い応答が生成されました (この差は統計的有意性に達しませんでした。図4f）は、この設定における一次中毒の影響が、相同ブースティングで観察されたものと比較して大幅に減少していることを再度示しています（図2g）。 我々は、たとえ一次依存症を完全に克服できなかったとしても、BA.1 は WH1 から十分に分岐しており、実質的な新規抗体反応を誘導すると結論付けています。 さらに、同種ブーストと異種ブーストの主な違いは、後者のみがドリフトひずみに対する堅牢な新規応答を誘発できることです。

a、予防接種戦略の概略図。 b、同種 (WWW) または異種 (WBB) 免疫化 S1pr2-IgkTag/Tag での表示用量投与 2 週間後の、抗 WH1 (左) および BA.1 RBD IgG 力価 (中央) および BA.1 シュードウイルスの NT50 (右)ネズミ。 P 値は両側 t 検定を使用して計算されました。 FC、フォールドチェンジ。 c、抗WH1およびBA.1 RBDタグ特異的力価の進化。 細い線は個々のマウスを表し、太い線は対数変換された力価値の中央値を結びます。 d、cに示した3回目の予防接種から2週間後のFlagおよびStrepの抗RBD力価（左）と一次中毒指数（右）の比較。 P 値は両側 t 検定を使用して計算されました。 e、3回目の投与から2週間後の、dと同じサンプルの抗フルSタグ特異的力価および一次中毒指数。 b ～ d の結果は 2 つの独立した実験からのものです。 各グループのマウスの数が示されています。 f、WBBマウスと初回投与および運命マッピングが省略されたマウスにおける新規Flag+抗体応答の比較(ØBB)。 ØBB データは、2 つの独立した実験からの 10 匹のマウスに関するものです。 WBB データは c からのもので、ØBB と同じアッセイで再測定されました。 g、中和アッセイのための抗体分画の概略図。 ｈ、ｄと同じ時点におけるＷＢＢマウスのＢＡ．１ ＮＴ５０力価。 枯渇後の NT50 値は、「方法」に記載されているように正規化されました。 P 値は、片側対応のある t 検定を使用して計算されました。 ｉ、抗ＲＢＤ ＢＡ．１ Ｓｔｒｅｐ＋（Ｆｌａｇ除去）およびＦｌａｇ＋（Ｓｔｒｅｐ除去）画分の効力。 各画分の生の NT50 値をそれぞれの RBD ELISA 力価で割りました。 P 値は、両側対応のある t 検定を使用して計算されました。 j、BA.1 のアミノ酸変化を赤で強調した WH1 RBD 構造 (PDB: 6M0J)。 ｋ、ｄと同様に３回目の免疫感作の２週間後に３匹のＷＢＢマウスから得られた血清サンプルの深部突然変異スキャニング分析。 RBD 上の抗体結合部位はエスケープ率に応じて網掛けされています。 各血清画分によって最も高度に標的化される位置が示されている(BA.1特異的残基は括弧内に示されている)。

異種追加免疫後に観察されたBA.1の中和の強化（図4b）が、この設定での新しいBA.1特異的抗体の誘導によるものであるかどうかを判断するために、3回目の免疫化の2週間後に採取したWBB血清サンプルをFlagに分画しました。 −枯渇（Ｓｔｒｅｐ＋、初代）およびＳｔｒｅｐ−枯渇（Ｆｌａｇ＋、新規）調製物（図４ｇおよび拡張データ図５ａ）を用いて、ＷＨ１およびＢＡ．１偽ウイルスに対するそれらの中和能力を測定した。 予想通り、Flag+抗体の枯渇はWH1中和に対する影響が最小限でしたが、Strep+の枯渇ははるかに大きな減少をもたらしました（それぞれ1.7倍対8.5倍;拡張データ図5b、c）。 対照的に、WBB血清から新しい（Flag+）抗体を除去すると、Strep+抗体が結合したにもかかわらず、一次（Strep+）抗体を除去した場合と比較してBA.1中和がより大きく減少しました（4.9倍対1.9倍の減少、図4h）。 ELISAによると、BA.1 RBDに対してより熱心に反応しました（図4d）。 特異的抗体の単位あたりの中和力価を推定するために、BA.1 シュードウイルスアッセイから得られた 50% 中和力価 (NT50) を BA.1 RBD 特異的 ELISA によって得られたエンドポイント結合力価で割りました。 この方法で反応性に対して正規化すると、新しい（Flag +）抗体は、WH1に応答して一次コホートB細胞クローンによって産生されたStrep +抗体よりも、BA.1の中和において平均7.0倍強力でした（図4i）。 拡張データ図 5d で計算されたように、WWW サンプルと比較した WBB による過剰な BA.1 中和の約 80% は、二次親和性成熟や優先的反応ではなく、ナイーブ細胞からの BA.1 特異的抗体の新規生成に起因する可能性があります。初代コホート記憶B細胞の選択。 したがって、BA.1 追加免疫後に一次中毒を回避する抗体は、変異株を中和するように最適化されています。

最後に、抗原浮動がどのようにして一次中毒の減弱につながるのかについてのメカニズムの洞察を得るために、異種ブーストマウスにおいてFlag+およびStrep+抗体によって標的化されるWH1およびBA.1 RBDエピトープを定義するために、深い突然変異スキャン31,32を実施した（図4jおよび拡張）データ図6）。 このアプローチにより、同じマウスの一次抗体と新規抗体が標的とするエピトープを個別に決定することができました。 BA.1 (Strep+ 抗体と Flag+ 抗体の両方) および WH1 RBD (Strep+ 抗体のみ) に対する 4 匹のマウスの抗体回避パターンを測定し、そのうち 3 匹は解釈可能な優勢ピークを示しました (拡張データ図 7)。 これら 3 匹のマウスでは、一次 Strep+ 抗体と新規 Flag+ 抗体の標的となるエピトープが明確に分離されていました (図 4k および拡張データ図 7)。 2匹のマウスでは、Strep + 抗体はRBDの外面に位置する「クラス3」エピトープの残基（Arg346、Arg357、Ile468）を標的としましたが、予想通り、これらはWH1とBA.1の間で保存されていました（図4j、k） ）。 対照的に、両方のマウスの Flag+ 抗体は、ACE2 結合表面の「クラス 2」領域の RBD の上部に位置する BA.1 特異的残基 Arg493 (WH1 では Gln493) に焦点を当てていました。 3 番目のマウスは、一次抗体と新しい抗体の間で同様の分離を示しましたが、異なるエピトープを標的としていました。 Strep+ 抗体は Gly485/Phe486 (ACE2 界面の RBD 上部) を含む保存されたクラス 1/2 エピトープに重点を置いていたのに対し、Flag+ 抗体は主に BA.1 特異的な Lys440 残基を含むエピトープに結合しました ( WH1 の Asn440)、Gly485/Phe486 (クラス 3) の遠位の RBD の側面にあります。 特に、N440K と Q493R は両方とも、さまざまなモノクローナル抗体による中和からの回避につながることが報告されています 33、34、35。 したがって、3匹のマウスはすべて、異種免疫によって誘発された新しい抗体がBA.1特異的エスケープ変異を含み、交差反応性一次抗体が結合するエピトープと重複しないエピトープを優先的に標的とするというロジックに従いました。 我々は、一次中毒はエピトープ特異的に作用することにより、保存されたエピトープに対する抗体の新規生成を抑制する一方、ドリフトエピトープを特異的に標的とする新しい抗体の誘導を可能にすると結論づけた。

まとめると、Κ タグ システムを使用した調査結果に基づいて、2 つの主要な点がわかります。 第一に、既存の免疫による新規抗体応答の抑制（我々が定義する OAS の必要な特徴）は、抗原距離ゼロで測定した場合、非常に強力です。 これらの発見は、最初のコホート反応が単に確立されたという理由だけでより大きいという逐次貢献/高齢性20モデルよりも、既存の反応が同じ抗原に対する新しい血清抗体の出現を妨げる一次中毒/OAS2モデル(図2a)を裏付けるものである。最初であるため、より多くの回数ブーストされます。 第二に、プライミング株とブースト株の間の抗原距離が増加するにつれて、一次中毒は著しく弱まります。 この観察は、OAS を一貫した方法で実験的に記録することがなぜ非常に困難であったのかの説明を示唆しています5。つまり、ドリフト抗原間の差異に依存して抗体を一次コホートまたは新規コホートに割り当てる従来の測定では、次の場合にのみこれらのコホートを確実に区別できる可能性があります。抗原距離が長すぎるため、一次中毒を明確に検出できません。 好例として、私たちのモデルは、OAS が最初に報告されたインフルエンザウイルス株である PR8 と FM1 の間の一次中毒は比較的弱い (de novo 反応の 3.8 倍の抑制に相当) と推定していることです。したがって、K タグ モデルによる精度がなければ確認することは困難です。

我々のデータは、季節性インフルエンザワクチン接種後、大部分の血清抗体クロノタイプが既存のプールから呼び戻されることを示すヒトでの観察と一致しているが、これらの研究では、ワクチン誘発性の抗体クロノタイプが新規応答から生じたのか、それとも新規応答から生じたのかについては不明のままであった。検出されなかった記憶B細胞の想起17,36。 ヒトは、インフルエンザ抗原への曝露歴が豊富であっても、即時の形質細胞応答をメモリー B 細胞に依存しながらも、リコール GC で実質的な新規応答を開始することができます 37。 したがって、ここで報告されている一次依存症の一般的な仕組みは、少なくとも一般的には人間にも当てはまると考えられます。 SARS-CoV-2 の状況では、OAS 型抑制は、同種ワクチン接種と比較した、変異型特異的または二価によるオミクロン中和の優先的誘導における小さくて変動しやすい差異を説明する可能性がある38、39、40、41、42。 我々のデータは、オミクロン追加免疫による新規抗体誘導の全範囲を明らかにするには、オミクロン含有ワクチンの2回目の投与が必要な可能性があることを示唆しています。 しかし、実際には、Omicron のブースティング前にほとんどの人が WH1 抗原に繰り返し曝露されているだけでなく、再活性化されたメモリー B 細胞の侵入を許容するヒト GC の潜在的な傾向がより強い 37 ことにより、Omicron 特異的抗体の OAS 型抑制がより強力になる可能性があります。現実のシナリオでは。

機構的には、抗原距離ゼロでの我々の測定は、マウスにおけるリコール GC と血清反応の間の機能的分裂を示しています。一方、前者はほぼナイーブ由来 B 細胞クローンのみで構成され 21、22、23、後者は一次中毒の影響によって支配されています。 この相違の潜在的な説明は、二次 GC に寄与するナイーブ B 細胞が形質細胞として GC を出るか、直接 ELISA で検出可能な抗体を分泌するのに十分な親和性がないということです。 ナイーブ由来の二次 GC B 細胞間の抗原結合が低いことは他の研究者によって以前に報告されており 22、これは後者の仮説と一致しています。 インフルエンザウイルスとSARS-CoV-2の両方の抗原ドリフトは主に免疫逃避によって引き起こされるため、異種環境におけるOASの緩和は原則として、新しくリクルートされたB細胞クローンをドリフトした中和エピトープに集中させるはずである。 この見解は、我々の中和実験とエピトープマッピング実験の結果によって裏付けられています。 さらに、一次中毒から逃れたRBD結合抗体は、交差反応性の第一コホート反応の主要な標的ではないエピトープ内に位置する新しい残基に焦点を当てる傾向があった。 このパターンは、一次中毒の潜在的なメカニズムとして、抗体媒介エピトープマスキング（ブースト前に存在する血清抗体、またはブーストされた記憶B細胞によって急性に産生される血清抗体が、特定のエピトープへの結合を巡ってナイーブB細胞と競合する）が示唆されている。 同様の効果は、マウスやヒトにおける免疫応答の誘導前にモノクローナル抗体を注入することによって以前に観察されており、想起応答の微細な特異性に影響を与えると予測されています43、44、45、46。 これらの発見は、一次中毒によってもたらされる新たな抗体反応の抑制が、抗原特異的ではなくエピトープ特異的である（抗原トラッピングではなくエピトープマスキング47）ことを示すだけでなく、なぜそれが記憶B細胞にとって有利であるかについての目的論的説明も示唆している記憶B細胞による競合は、ウイルスエスケープ変異体の新しいエピトープに合わせた抗体を生成するナイーブ細胞の能力を阻害する可能性があるため、二次GCへの再侵入を回避するためである21,48。 このようなフレームワークでは、セカンダリ GC の主な役割は、OAS の最悪の影響を回避することになります。

WT C57BL/6J および B6.C(Cg)-Cd79atm1(cre)Reth/EhobJ (Cd79aCre/+、Mb1-Cre49 としても知られる) マウスを The Jackson Laboratory から入手しました。 S1pr2-creERT2 BAC トランスジェニック マウス 25 は、黒崎 T. および岡田 T. から寄贈されました。 IgkTag マウスはロックフェラー大学で作成されました。 我々は、図1aおよび拡張データ図1に示すように、終止コドンおよびSV40ポリA転写ターミネーターによって分離されたFlagタグ(DYKDDDDK)およびStrep-IIタグ(WSHPQFEK)を備えた対立遺伝子を設計した。 522 ヌクレオチドの一本鎖 DNA テンプレート (それぞれ 100 ヌクレオチド長の 5' および 3' 相同アームを含む) と CRISPR ガイド RNA (GGAGCTGGTGGTGGCGTCTC) を IDT から購入し、Easi-CRISPR 遺伝子ターゲティング法 50 に従って調製しました。ロックフェラー大学遺伝子ターゲティング リソース センターで使用され、ロックフェラー大学トランスジェニック サービス中核施設によって C57BL/6 マウスから取得された接合子に注入されました。 相同アームの外側に位置するゲノムプライマーを使用して、遺伝子座全体にわたるサンガー配列決定によって対立遺伝子が正しく挿入されたことを確認しました。 潜在的な CRISPR オフターゲット効果のリスクを減らすために、1 匹の創始者マウスを実験で使用する前に C57BL/6J マウスと少なくとも 5 世代にわたって戻し交配しました。 IgkFlag/Strep マウスを作製するために、Cd79aCre/+IgkTag 育種における時折の自発的生殖系列組換えから得られた生殖系列切除 (Strep+ B 細胞表面染色を示す Cre 陰性マウス) マウスを親 IgkTag 株と交配しました。 すべてのマウスは、特定の病原体が存在しない条件下でロックフェラー大学のイムノコアクリーン施設に保管されました。 すべてのマウス手順は、ロックフェラー大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

免疫応答は、1/3 量の Imject ミョウバン (Thermo Fisher Scientific) を添加した 10 μg TNP17 -KLH (Biosearch、T-5060) を足蹠皮下免疫化するか、またはミョウバンまたは水酸化アルミニウムゲル（アルヒドロゲル、Invivogen）の1/3容量で調製した50μgのTNP-KLHによる腹腔内免疫化。 アルヒドロゲル中の組換えにより生成された三量体安定化 HA (下記参照) 20 μg。 以下に説明するように生成された、脂質ナノ粒子（mRNA-LNP）にカプセル化された3μgのWH1（参考文献51）またはBA.1スパイクmRNAによる大腿四頭筋の筋肉内免疫化。 または、発育鶏卵で産生されたマウス適応型 PR8 インフルエンザウイルスの鼻腔内感染によるもの（約 33 プラーク形成単位、M. Carroll より提供）。 S1pr2-IgkTag マウスでは、12 日目のフローサイトメトリー実験の 4 日目と 8 日目に、トウモロコシ油に溶解した 50 mg ml-1 のタモキシフェン (Sigma-Aldrich) 200 μl を強制経口投与することにより、一次免疫応答を運命地図化しました (図 1)、他のすべての免疫実験では 4、8、12 日目、インフルエンザ感染実験では 4、8、12、16 日目 (図 3)。 TNPリコール実験（図2c）では、示された時点で初回免疫と同様に追加免疫を実施しました。 相同mRNA-LNP実験（図2e）の場合、ブースティングはプライミングと同じ方法で実行されましたが、一部のマウスでは左大腿四頭筋がブーストされました（拡張データ図3eでは反対側に階層化されています）。 異種 mRNA-LNP リコール実験 (図 4) では、ブースティングはすべてのケースで対側で行われました。 HA 免疫化実験 (図 3) では、同種または異種 HA タンパク質の追加免疫を、一次免疫化とまったく同様に同側で実施しました。 感染実験では、以前に記載されているように、3 か月後に 1/3 容量のアルヒドロゲルで調製した 5 μg HAPR8 または HAFM1 を足蹠に皮下免疫してマウスを追加免疫しました 21。 すべての場合において、追加のブースター免疫化は最初の追加免疫と同様に実施されました。 血液サンプルは、凝固活性化剤血清ゲル（Sarstedt、41.1378.005）で調製されたマイクロチューブに頬穿刺によって収集されました。

免疫化およびELISAに使用される組換えHAは、以前に記載されているように、CHO細胞タンパク質発現システムを使用して社内で生成されました21。 H1/A/California/07/2009 について最初に記載されているように (参考文献 52)、システイン残基が HA 配列に導入され、三量体安定化ジスルフィド結合が形成されました。 HAPR8 と HACA09 の生成については以前に説明しました 21。 HAFM1 および HANC99 についても、三量体安定化変異の導入を含む同じ手順に従いました。 免疫化のために、HA に本来備わっていない C 末端ドメイン (フォールドン、Avi タグ、His タグ) をトロンビン切断によって除去し、その後 HA を高速タンパク質液体クロマトグラフィー (FPLC) で精製してから、リン酸緩衝食塩水 (PBS) に保存しました。 。 ELISA には、トロンビン処理されていない FPLC 精製タンパク質を使用しました。 CGG 免疫マウスから得られた高親和性 IgY 特異的モノクローナル抗体 (クローン 2.1 (参考文献 53)) を、Flag/Strep ELISA 検出の標準として使用するために修飾しました。 元のヒトモノクローナル抗体プラスミド 54 の重鎖および軽鎖定常領域はマウス IgG1 および Igκ 定常領域で置き換えられ、Cκ の C 末端は LoxP 部位と Ser-Gly-Gly リンカーの後に Flag またはStrep-tag は、それぞれ組換え前後で IgkTag マウスによって生成された Cκ 鎖と同一の Cκ 鎖を生成します。 mAb-Flag または mAb-Strep 軽鎖プラスミドを重鎖プラスミドとともに HEK293F 細胞 (Thermo Fisher Scientific、R79007) にトランスフェクトし、以前に記載されているようにプロテイン G アフィニティー クロマトグラフィーを使用して精製しました 53。 細胞株はマイコプラズマの検査では陰性であり、細胞株が生産するタンパク質の検査以外には認証されませんでした。 Flag+ と Strep+ の抗 TNP 抗体力価間の親和性成熟を比較するために (図 1h)、カスタムの低ハプテンおよび高ハプテンのウシ血清アルブミン (BSA) コンジュゲーションを社内で作成しました。 2.5 mg ml-1 の BSA (PBS 溶液、Thermo Fisher Scientific、77110) を、20% ジメチルスルホキシドを含む PBS 中で、次のいずれかのモル比で TNP-ε-アミノカプロイル-OSu (Biosearch Technologies、T-1030) とインキュベートしました。 2または1:20で回転させながら室温で2時間放置します。 結合していないTNP-ε-アミノカプロイル-OSuをPBS中での透析により除去した。 280 および 348 nm での吸光度を測定することにより、最終的な TNP:BSA 結合比は約 1:1 および約 1:13 であると推定されました。これらの試薬は TNP1-BSA および TNP13-BSA と呼ばれます。 BSA 濃度は、280 nm での TNP-ε-アミノカプロイル-OSu の吸光係数を測定することによって補正されました。 図1hを除き、他のすべてのTNP ELISA（下記）には市販のTNP4-BSA（Biosearch Technologies、T-5050）を使用しました。

WH1 S mRNA ワクチンは、SARS-CoV-2 S タンパク質配列 (武漢-Hu-1、GenBank: MN908947.3) に基づいて設計されており、986 ～ 987 位のリジンおよびバリンアミノ酸がプロリン残基に修飾されています。融合前に安定化された mRNA にコードされた免疫原を取得します。 BA.1 S アミノ酸配列は、BA.1 特異的修飾を導入することによって WH1 S から得られました。 WH1 および BA.1 S のコード配列は、以前に記載されているようにコドン最適化、合成され、mRNA 産生プラスミド (GenScript) にクローン化されました 55。 mRNA の生成と LNP のカプセル化は、以前に記載されているように実行されました 55。 簡単に言うと、mRNA は 101 ヌクレオチド長のポリ (A) テールを含むように転写されました。 UTP の代わりに m1Ψ-5'-三リン酸 (TriLink) を使用して、修飾ヌクレオシド含有 mRNA を生成しました。 インビトロで転写された mRNA のキャッピングは、トリヌクレオチド cap1 アナログである CleanCap (TriLink) を使用して共転写的に実行されました。 以前に記載されているように、mRNA はセルロース (Sigma-Aldrich) 精製によって精製されました 56。 すべての mRNA はアガロースゲル電気泳動によって分析され、-20 °C で凍結保存されました。 セルロース精製された m1Ψ 含有 RNA は、前述の自己集合プロセスを使用して LNP にカプセル化され、イオン化カチオン性脂質、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびポリエチレングリコール脂質のエタノール性脂質混合物が、mRNA を含む水溶液と酸性で急速に混合されました。 pH57。 イオン化可能なカチオン性脂質およびLNP組成物は、特許出願WO 2017/004143に記載されている。 RNAをロードした粒子は特性評価され、その後1μg μl-1の濃度で-80℃で保存されました。 これらの mRNA-LNP の平均流体力学的直径は約 80 nm で、多分散指数は 0.02 ～ 0.06、カプセル化効率は約 95% でした。

末梢 B 細胞のフローサイトメトリー分析では、凝固を防ぐためにエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含む血液をマイクロチューブに収集し、赤血球を溶解するために塩化アンモニウム - 塩化カリウム (ACK) 緩衝液 (Lonza) で処理しました。 リンパ節サンプルについては、使い捨て微乳棒（Axygen）を用いた機械的解離によって細胞懸濁液を得た。 脾臓を70μmセルストレーナーで濾過することによりホモジナイズし、ACK緩衝液で処理した。 骨髄細胞は、穿刺された脛骨と大腿骨を最大 10,000g で 10 秒間遠心分離することによって抽出され、その後 ACK バッファーで処理されました。 各組織からの細胞を、0.5% BSAおよび1 mM EDTAを添加したPBSに再懸濁し、最初にFCブロック（ラット抗マウスCD16/32、2.4G2、Bio X Cell）とともに氷上で30分間インキュベートし、その後、さまざまな蛍光を用いてインキュベートしました。標識抗体 (補足表 1) を 30 分間処理します。 細胞を濾過し、同じ緩衝液で洗浄した後、BD FACS Symphony サイトメーターで分析しました。 データは FlowJo (v.10) を使用して分析されました。

IgkTag マウスにおけるエピトープタグ付き抗体の存在を確認するために、定常状態の成体マウスからの血清サンプルとプレシジョン プラス デュアルカラー タンパク質標準 (Bio-Rad) を SDS-PAGE ミニプロテアン TGX タンパク質ゲル (Bio-Rad) 上で 3 回実行しました。 Rad) を変性条件下で照射し、抗体の重鎖と軽鎖を分離します。 Iblotゲル転写システム(Invitrogen)を使用して、サンプルをポリ二フッ化ビニリデン膜に転写した。 膜を、PBS-Tween-20 (0.05%) 中の 5% 脱脂粉乳とともに穏やかに振盪しながら室温で 2 時間ブロックし、その後、1:2,000 の抗 Flag-HRP (D6W5B、D6W5B) を含む同じ緩衝液中で一晩インキュベートしました。 Cell Signaling Technology、86861S）または抗Strep（Strep-tag II StrepMAB-Classic、Bio-Rad、MCA2489P）またはヤギ抗マウスIgκ-HRP（Southern Biotech、1050-05）。 膜をPBS-Tween-20で十分に洗浄し、その後、Azure c300ゲルイメージャー(Azure Biosystems)を使用して化学発光検出を行う前に、ウェスタンブロッティングECL基質(Amersham)とともにインキュベートした。

ELISA は、Flag/Strep を直接比較できるように特別な変更を加えて、以前に記載されているように実行されました 21。 Flag/Strep ELISA を、各 96 ウェル プレート上で内部標準を使用して並べて実行しました。 抗原特異的な血清抗体力価を検出するために、プレートを PBS 中の抗原 (TNP4-BSA については 10 μg ml-1、社内で結合した TNP1/13-BSA については 2 μg ml-1 (上記を参照）、HA および SARS-CoV-2 スパイクまたは RBD タンパク質については 1 μg ml-1（Sinobiological、40592-V08H、40592-V08H121、40589-V08H26; WH1 S および RBD タンパク質は P. Wilson からの贈り物） ）。 Flag/Strep標準曲線の場合、ウェルを10μg ml-1の精製IgY(Gallus Immunotech)でコーティングした。 ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄した後、プレートをＰＢＳ中の２．５％ＢＳＡを用いて室温で２時間ブロックした。 血清サンプルを PBS で 1:100 に希釈し、3 倍希釈で連続滴定しました。 マウス抗 IgY mAb-Flag または mAb-Strep も 3 倍希釈で連続滴定しました (拡張データ図 2d)。 サンプルを 2 時間インキュベートし、次に PBS-Tween で洗浄した後、次の HRP 検出抗体の 1 つを添加しました: ヤギ抗マウス IgG (Jackson Immunoresearch、15-035-071)、ラット抗マウス Igκ (Abcam、 ab99632）、ヤギ抗マウス IgM（Southern Biotech、1020-05）、ウサギ抗 Flag-HRP（D6W5B）またはマウス抗 Strep（Strep-tag II StrepMAB-Classic）を 30 ～ 45 分間反応させます。 抗Flag抗体および抗Strep抗体の希釈は、FlagタグおよびStrepタグ付きモノクローナル抗体の滴定によって生成された曲線が等しくなるように定義されました（拡張データ図2d）。 PBS-Tweenで洗浄した後、サンプルを3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン基質(低速速度型、Sigma-Aldrich)とともにインキュベートし、反応を1N HClで停止させた。 光学密度（OD）吸光度は、Fisher Scientific accuSkan FC プレートリーダーで 450 nm で測定しました。 Flag および Strep のエンドポイント力価を正規化するために、各サンプルが 20 または 6.67 ng µl-1 の固定濃度でそれぞれのモノクローナル抗体の閾値 OD 値を通過する血清力価希釈を計算しました。 力価は、使用したモノクローナル抗体の OD のすぐ上およびすぐ下の読み取り値を用いて、希釈液の対数補間によって計算されました 58。

総血清 IgG ELISA の場合、プレートを抗マウス IgG でコーティングしました。 標準曲線は、非標識マウス IgG (Southern Biotech、0107-01) を使用して作成し、検出は抗マウス IgG-HRP (Southern Biotech) を使用して実行されました。 血清サンプルから IgM を除去するために、抗マウス IgM アガロース ビーズ (Sigma-Aldrich、A4540) を製造業者の指示に従って使用しました。 ビーズを PBS で洗浄し、サンプルとビーズの比率 1:20 で回転させながら 4 °C で一晩インキュベートしました。 ビーズに結合した IgM 画分を 10,000g で 3 分間遠心分離して除去し、結合していない上清画分をその後の ELISA に使用しました。 IgM枯渇の効率を確認するために、ヤギ抗マウスIgM、非標識IgMおよび抗マウスIgM-HRP(Southern Biotech)を用いて、総IgGについて上述したように総IgMレベルを測定した。

ウイルス中和力価は、S mRNA-LNP 免疫化 S1pr2-IgkTag マウスから収集したサンプルの Flag+ 血清画分と Strep+ 血清画分で評価しました。 画分を分離するために、抗Flag M2磁気ビーズ(Sigma-Aldrich、M8823-5ML)およびMagStrepタイプ3XTビーズ(IBA、2-4090-010)を使用した免疫沈降を、製造業者の指示に従って実行した。 簡単に説明すると、磁気ビーズをサンプルバッファー (Flag ビーズの場合は Tris 緩衝生理食塩水、MagStrep ビーズの場合は 1x バッファー W (IBA、2-1003-100)) で洗浄し、サンプルを 20:1 のサンプルの比率でインキュベートしました。回転させながら 4 °C で一晩ビーズ樹脂にします。 ビーズ結合画分は磁気分離器を使用して分離して廃棄し、非結合画分を収集した。 分別したサンプルを遠心分離により投入濃度の半分まで濃縮し、熱不活化しました。 総血清サンプルと分画血清サンプルが WH1 および BA.1 SARS-CoV-2 を中和する程度は、以前に記載された SARS-CoV-2 スパイクシュードタイプ HIV-1 ベースの NanoLuc ルシフェラーゼ レポーター アッセイを使用して概算されました 29。 簡単に説明すると、血清サンプルを最終最高希釈 1:00 の血清で 5 倍連続希釈し、SARS-CoV-2 WH1 または BA.1 スパイクシュードタイプ HIV-1 レポーター ウイルスとともに 37 °C で 1 時間インキュベートした後、 HT1080/ACE2.cl14細胞に移される59。 48時間後、細胞を洗浄および溶解し、Nano-Glo ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)およびGlomax Navigator照度計(Promega)を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。 相対発光単位は、血清の非存在下で感染させた細胞を使用して正規化し、GraphPad Prism でプロットしました。 NT50 値は、拡張データ図 5b に示す曲線の 4 パラメーター非線形回帰 (重み付けなしの最小二乗回帰法) を使用して計算されました。 2 つの技術的重複の平均が表示され、外れ値の点は除外されています。 インプットとフラクション間のNT50比較（図4gおよび拡張データ図5c）では、インプット中の対応するELISA力価と比較して、非枯渇タグのBA.1 RBD ELISA力価が等しくなるように分別サンプルのNT50を調整しました。分数。

SARS-CoV-2 Omicron BA.1 スパイク RBD のバックグラウンドで重複した単一変異部位飽和バリアント ライブラリが設計され、Twist Bioscience によって製造されました。これは、他の SARS-CoV-2 バリアントに対して以前に行われたものと本質的に同じです60。 61. 酵母ディスプレイベクター内の非変異 Omicron BA.1 RBD をコードするプラスミドの GenBank マップは、GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_DMS_Omicron/blob/main/data/3294_pETcon) で入手できます。 -SARS2-RBD_Omicron-BA1.gb)。 部位飽和バリアント ライブラリは、Twist Bioscience によって二本鎖 DNA フラグメントとして提供され、バーコード化され、酵母ディスプレイ ベクター バックボーンに一括してクローン化されました。 バーコード付き変異体ライブラリーのプラスミド DNA を大腸菌 (NEB 10-ベータ エレクトロコンピテント セル、New England BioLabs、C3020K) にエレクトロポレーションし、ボトルネックを約 1 × 105 CFU (単一変異体あたり平均 >25 バーコード) にしました。 プラスミド DNA を精製し、AWY101 酵母株に形質転換しました。 16 ヌクレオチドのバーコードは、PacBio シークエンシングによって BA.1 変異体と関連付けられ、基本的に記載されているように、RBD 発現および ACE2 結合の変異の影響が測定されました 61。 これらの実験は GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_DMS_Omicron) で説明および分析されています。

免疫マウス由来の血清の RBD 結合を低下させる変異をマッピングする実験は、モノクローナル抗体 62 およびヒト ポリクローナル血漿サンプル 63 について前述したのと同様に、独立した変異体 WH1 または BA.1 RBD ライブラリーを用いて生物学的に重複して実施されました。 まず、前述のように、75 μl の各血清を、空のベクターを含む 37.5 OD ユニットの AWY101 酵母とともに室温で 2 時間、または 4 °C で一晩インキュベートすることにより、非特異的酵母結合抗体を 2 回除去しました 63 。 WH1 および BA.1 変異体 RBD 酵母ライブラリー 61 は、カザアミノ酸 (SD-CAA、6.7 g l-1 酵母窒素塩基、5.0 g l-1 カザアミノ酸、1.065 g l-1 MES) を含むガラクトース含有低ブドウ糖合成規定培地で誘導されました。酸および２％（ｗ／ｖ）ガラクトース＋０．１％（ｗ／ｖ）デキストロース）を加えてＲＢＤを発現させ、洗浄し、穏やかに撹拌しながら希釈血清とともに室温で１時間インキュベートした。 Strep抗体またはFlagタグ抗体の結合の喪失について、各WH1またはBA.1 RBD変異体ライブラリーに対するマウス血清の各組み合わせの試験を独立して実施した。 各血清について、RBD に結合する血清抗体による蛍光シグナルの量がサンプル間でほぼ等しくなるように、亜飽和希釈を使用しました (WH1 ライブラリーに対する Strep 抗体のマッピングの場合は 1:1,000、Strep 抗体のマッピングの場合は 1:200) BA.1 ライブラリに対する Flag 抗体のマッピングの場合は 1:50)。 次に、酵母ライブラリーを 1:100 FITC 結合抗 MYC 抗体 (Immunology Consultants Lab、CYMC-45F) で 1 時間二次標識し、RBD 発現を標識するか、1:200 APC 結合ストレプトアビジン (Invitrogen S-868) で標識しました。結合した Strep 抗体を標識するか、または APC 結合ラット抗 Flag (BioL​​egend、637308) を標識して、結合した Flag タグ付き抗体を標識します。 フローサイトメトリー選択ゲートは、RBD 発現の程度に応じて抗体結合が低下した RBD 変異体を捕捉するために描画されました。 各サンプルについて、約 4 × 106 個の細胞が BD FACSAria II セルソーターで処理されました。 血清から逃げた細胞を、プラスミド抽出前に細胞を増殖させるために、2% (w/v) ブドウ糖、ガラクトースなし、および 100 U ml-1 ペニシリン + 100 μg ml-1 ストレプトマイシンを含む、上で定義した SD-CAA 中で一晩増殖させました。

プラスミド DNA は、事前選択酵母集団の 30 OD ユニット (1.6 × 108 コロニー形成単位 (CFU)) と、血清を逃がした細胞の一晩培養物の約 5 OD ユニット (約 3.2 × 107 CFU) (Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II) から抽出されました。 ）前述したように60、62。 各 WH1 または BA.1 RBD バリアントを識別する 16 ヌクレオチドのバーコードは、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され、以前に記載されているようにイルミナ配列決定用に調製されました 60,62。 バーコードは、Illumina NextSeq 2000 システムで 50 bp シングルエンド読み取りで配列決定されました。

エスケープ率は、基本的に前述のように計算されました62。 dms_variants パッケージ (https://jbloomlab.github.io/dms_variants/、v.1.4.0) を使用して、各事前選択および血清エスケープ母集団内のバーコード化された各 RBD バリアントをカウントしました。 選択ごとに、参考文献で提供されている式によって各バーコード化バリアントのエスケープ率を計算しました。 62. これらのエスケープ画分は、エスケープビンに該当する特定の変異体を発現する細胞の推定画分を表し、値 0 は変異体が常に血清に結合していることを意味し、値 1 は変異体が常に血清結合から逃れることを意味します。 次に、計算フィルターを適用して、1 個を超えるアミノ酸変異、低い配列決定数 (事前選択条件では <50)、または酵母上で適切に折りたたまれた RBD の発現低下を引き起こすだけで抗体エスケープを引き起こす可能性がある非常に有害な変異を含む変異体を除去しました。細胞表面（2つの野生型RBDの異なるベースライン発現レベルを反映する、WH1およびBA.1変異体ライブラリーのACE2結合スコア<-2またはRBD発現スコア<-1.25または<-0.83361） 。 論文全体で報告されている抗体エスケープ スコアは、重複したライブラリの平均です。 これらのスコアは補足表 1 にも記載されています。最終的な単一変異体エスケープ スコアの相関関係は拡張データの図 6c に示されています。 計算分析の完全なドキュメントは、GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS) で入手できます。

血清エスケープ マップのロゴとライン プロットは、dmslogo パッケージ (https://jbloomlab.github.io/dmslogo、v.0.6.2) を使用して作成されました。 各文字の高さは、そのアミノ酸変異のエスケープ率を示します。 各血清について、ロゴ プロットは、ライブラリ/抗体タグが 1 つ以上の条件で、部位合計の抗体エスケープがすべての部位の中央値の 10 倍を超え、任意の部位の最大値の少なくとも 10% である任意の部位を特徴としています。 各サンプルについて、y 軸は、(1) そのサンプルで観察された最大の部位別逸脱測定基準、または (2) その血漿のすべての部位で観察された部位別逸脱率の中央値の 20 倍の最大値になるようにスケールされました。 これらのロゴ プロットの視覚化を生成するコードは、GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/summary/escape_profiles.md) で入手できます。 RBD 構造上の血清エスケープを視覚化するために、WH1 RBD 表面 (PDB: 6M0J) を各部位の部位ごとのエスケープ メトリックによって色分けしました。白はエスケープがないことを示し、赤は最もエスケープが多い部位を示します。

条件を比較するために使用される統計的検定は、図の凡例に示されています。 サンプルサイズを決定するために統計的手法は使用されませんでした。 統計分析は、GraphPad Prism v.9 を使用して実行されました。 フローサイトメトリー分析は、FlowJo (v.10) を使用して実行されました。 グラフは Prism (v.9) を使用してプロットされ、Adobe Illustrator CS を使用して外観を編集されました。 対数スケールでプロットされたデータ (血清抗体力価など) については、対数変換されたデータに対して統計分析が実行されました。 反応性が検出限界未満のサンプルには、最高希釈が 1:100 であるため、値 100 が割り当てられました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

深度変異スキャン実験から得られた 16 ヌクレオチドのバリアント バーコードの Illumina の生の読み取り値は、BioProject PRJNA770094、BioSample SAMN30086726 の下で NCBI SRA で入手できます。 すべてのエスケープ スコアは補足表 1 に示されており、GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/supp_data/all_raw_data.csv) で入手できます。 スパイク RBD および HA 構造のレンダリングは、アクセッション コード 6M0J、1RU7、および 3LZG で PDB から取得されました。

深部突然変異スキャン実験の分析に使用された完全なコードは、GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS) で入手できます。 ロゴ プロットの視覚化を生成するコードは、GitHub (https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/summary/escape_profiles.md) で入手できます。

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Kタグマウス株の作製についてはロックフェラー大学のトランスジェニックおよびジーンターゲティング施設のスタッフ、およびマウスの飼育については比較生物科学センターのスタッフに感謝します。 組換えSARS-CoV-2 WH1スパイクおよびRBDタンパク質についてはP. Wilson。 JT Jacobsen による技術支援。 ロックフェラー大学スタッフ全員、継続的なサポートに感謝します。 この研究は、NIH/NIAID の GDV に対する R01AI119006 および R01AI139117、PDB に対する P01AI165075、NP に対する R01AI146101 および R01AI153064、および JDB に対する R01AI141707 の助成金によって資金提供されました。 Victora 研究室での研究は、NIH 助成金 DP1AI144248 (パイオニア賞) によってさらに支援されています。 ）とロバートソン財団。 AS はベーリンガー・インゲルハイム財団博士フェローシップによって支援されました。 PDB と JDB は HHMI 調査員です。 GDV は感染症の病因に関するバローズウェルカム研究者であり、ピュー・スチュワート奨学生であり、マッカーサーフェローでもあります。

リンパ球動態研究室、ロックフェラー大学、ニューヨーク州、米国

アリエン・シーパース、マリジェ・FL・ファント・ワウト、ルカ・メーシン、ガブリエル・D・ヴィクトラ

米国ワシントン州シアトル、フレッド・ハッチンソンがん研究センター、基礎科学部門および計算生物学プログラム

アリソン・J・グリーニー、タイラー・N・スター、ジェシー・D・ブルーム

ロックフェラー大学、レトロウイルス学研究室、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国

トリニティ・ザン & ポール・D・ビエニアス

米国ペンシルバニア州フィラデルフィア、ペンシルバニア大学ペレルマン医学部微生物学科

Hiromi Muramatsu & Norbert Pardi

Acuitas Therapeutics、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ

パウロ JC リン & イン K. タム

ハワード・ヒューズ医学研究所、チェビー・チェイス、メリーランド州、米国

ポール・D・ビエニアス & ジェシー・D・ブルーム

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AS および MFLv'tW は、TNS および JDBNP の監督の下、LMAJG からの重要なインプットを利用して、すべての実験作業を実施し、解釈しました。HM は、WH1 および BA.1 S をコードする mRNA を設計および生産しました。 PJCL と YKT は mRNA を LNP に配合しました。 TZ は PDBAS の監督の下で偽ウイルス中和アッセイを実施し、GDV は K タグ対立遺伝子と研究のすべての実験を設計し、著者全員からの意見をもとに原稿を執筆しました。

ガブリエル・D・ヴィクトラへの通信。

NP は、ワクチンプラットフォームとしての LNP におけるヌクレオシド修飾 mRNA の使用を記載した特許 (62/153,143 — 適応免疫応答を誘導するヌクレオシド修飾 RNA) に名前が付けられています。 彼はこれらの利益をペンシルベニア大学に完全に開示しており、その特許のライセンス供与から生じる潜在的な紛争を管理するための承認済みの計画を立てています。 PJCL と YKT は、mRNA-LNP 治療薬の開発に携わる Acuitas Therapeutics の従業員です。 YKT は、mRNA を含む核酸治療薬の送達のための LNP、およびワクチンプラットフォームとしての脂質ナノ粒子内の修飾 mRNA の使用について記載した特許 (WO 2017/004143 — 核酸送達のための脂質および脂質ナノ粒子製剤) に基づいて命名されています。 。 PDBはファイザー向けに新型コロナウイルスワクチン分野のコンサルティング業務を行ってきた。 JDB は、ウイルス、ワクチン、ウイルスの進化に関連するテーマについて、Apriori Bio、Oncorus、Merck、Moderna に対してコンサルティングを行っているか、最近コンサルティングを行っています。 JDB、TNS、および AJG は、ウイルスの深部変異スキャンに関連する Fred Hutch ライセンス特許 (62/935,954 および 62/692,398) の発明者としてリストされています。 GDV と JDB はワクチン会社のアドバイザーです。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

IgkTag 対立遺伝子の生成に使用される 522 bp DNA テンプレートのヌクレオチド配列。すべてのコード配列にアミノ酸翻訳が示されています (太字)。 ヌクレオチド番号は各行に示されています。 アミノ酸の翻訳は、各コドンの中心ヌクレオチドの下に位置します。

（ a ）WTおよびIgkTag / Tagマウスの血液から得られた末梢B細胞（ゲート：B220 + CD4 – CD8 – CD138 –）の代表的なフローサイトメトリープロット。IgλおよびFLAGタグ付き免疫グロブリンの表面発現について染色されています。 (b) WT、IgkTag/Tag、および Cd79aCre/+ の血清中の総 IgG 濃度。 ELISAによって測定されたIgkTag/Tagマウス。 一元配置分散分析では差は有意ではありませんでした (p < 0.05)。 (c) 成体 (6 週齢) IgkFLAG/Strep マウスから得られた定常状態の骨髄形質細胞 (PC) のフローサイトメトリー。 PC のゲーティング戦略を左のパネルに示し (非 CD4/CD8 T 細胞で事前にゲーティング済み)、表面 IgA+ および Igλ- PC については中央のパネルに、FLAG/Strep については右のパネルに示します。 3 回の独立した実験から得た 9 匹のマウスの定量を右端のパネルに示します (各点は個々の IgkFLAG/Strep マウスを表し、線は中央値を表します)。 (d) 曲線が重なる各HRP抗体の希釈液で検出されたモノクローナル抗体(mAb)-FLAGおよびmAb-Strepを用いたELISA標準曲線。 方法セクションで説明したように、曲線が吸光度バックグラウンド閾値 (点線で示す) と交差する mAb 濃度を使用して、エンドポイント力価を計算しました。 （ e ）黒い矢印で示された時点でTNP-KLH /ミョウバンで腹腔内免疫および追加免疫したIgkFLAG / Strepマウスにおけるタグ特異的抗TNP力価。 結果は 2 つの独立した実験からの 14 匹のマウスからのものです。 7日目の時点は最初のコホートでは収集されませんでした。 細線は個々のマウスを表し、太線は各時点での対数変換された力価値の中央値を結びます。 （ f ）図1d、eのようなS1pr2-IgkWT / Tagマウスのフローサイトメトリー。 (g) の定量化には、タモキシフェンを含む対照群とタモキシフェンを含まない対照群が含まれます。 データ ポイントは、少なくとも 2 回の独立した実験からのグループあたり 6 ～ 13 個の膝窩リンパ節からのものです。 （h）図1dのように免疫したS1pr2-IgkTag/Tagマウスの抗TNP ELISA反応性。 タモキシフェンを投与された６匹のマウスとタモキシフェンを投与されなかった４匹のマウスから血清を４７ｄｐｉで得た。 IgG (左)、FLAG (中央)、および Strep (右) ELISA 吸光度を示します。 サンプルを 1:100 に希釈しました。

（ a ）4、8、および12 dpiでタモキシフェン標識した、3匹のTNP-KLH ipプライミングおよびブーストS1pr2-IgkTag/Tagマウスの脾臓における二次GCのフローサイトメトリー。 図1eのように、FLAGまたはStrepタグを発現するGC B細胞（FAS + CD38 – B220 + CD4 – CD8 – CD138 –）でゲートされました。 (b) ELISA によって測定された、免疫沈降による IgM 除去前後の血清サンプルの総 IgM 濃度。 データは、図 2c と同じ 4 匹のマウスからの 8 つの血清サンプルからのものです。 （ c ）TNP-KLHによる1回目および2回目の追加免疫の6日後に収集されたサンプルのIgM枯渇前後のタグ特異的抗TNP力価（（b）および図2cと同じサンプル）。 棒は対数変換された力価の平均を表し、誤差棒はSEMである。 P 値は両側の対応のある T 検定に対するもので、統計的に有意な (p < 0.05) 値のみが表示されます。 （ d ）図2b、eのように免疫化したが、タモキシフェンで処理しなかったS1pr2-IgkTag/Tag対照マウスにおけるバックグラウンドStrep+抗RBD力価。 グラフは、タモキシフェン非存在下での追加免疫前の時点と、2回目および3回目の予防接種から2週間後の、Strep+である抗RBD力価の中央値パーセンテージ((S/(S + F)*100))を示しています。 これは、リコール応答における FLAG+ 力価が S1pr2-CreERT2 ドライバーによる自発的組換えによって過小評価される可能性がある割合の中央値を表します。 データは 2 つの独立した実験からの 8 匹のマウスからのものです。 （ e ）図2e、fに示す一次中毒データの比較。コホートおよび同側対対側のブーストによって階層化されています。 マウスの第 4 コホートは、図 4b ～ e に示す相同的に追加免疫されたグループであり、ここでは白丸で示されています。 バーは対数変換された力価の平均を表し、エラーバーはSEMである。 データは 4 つの独立したコホートからの 16 匹のマウスからのものです。 （ f ）図2e、f、hのデータに基づく、2つのコホートからの9匹のマウスにおける3番目と4番目の反応の間の一次中毒の比較。 バーは対数変換された力価の平均を表し、エラーバーはSEMである。

(a) インフルエンザウイルス PR8 による一次感染の有無における HAFM1 に対する de novo FLAG+ 抗体応答の比較。 PR8>FM1>FM1 データは、図 3d と同じサンプルのものであり、Ø>FM1>FM1 と同じアッセイで再測定されました。 (b) HA プライムブースト戦略の概略図。 S1pr2-IgkTag/Tagマウスをアルヒドロゲル中のHANY95で腹腔内初回刺激し、示されるようにアルヒドロゲル中のHAN99またはHACA09で同種または異種追加免疫した。 （ c ）同じマウスの抗 HA タグ特異的 ELISA 反応性の全時間経過（1:100 希釈での光学密度）を図 3f に示します。 抗 HANY95 (上)、HANC99 (中央)、および HACA09 (下) ELISA と、Strep (左) および FLAG (右) 検出を示します。 (d) 感染および予防接種実験における一次中毒と抗原距離との関係。 グラフは図 3d と 3g からの一次依存指数をまとめたものです。 バーは、プライミング HA とブースティング HA 間のアミノ酸の同一性によって並べられています。 P 値は、カテゴリカル変数として同一性 % を使用した一元配置分散分析、または線形変数として (100 – 同一性 %) を使用したピアソン相関です。

(a) 入力サンプルと除去後のサンプルの抗 RBD ELISA によって測定した、FLAG および Strep 除去画分への血清分画の効率。 血清は、３回目の免疫化の２週間後に異種免疫化マウスから得た（図４ｄ）（２つの独立した実験からの８匹のマウス）。 (b) (a) に示した血清画分による、WH1 (左) および BA.1 (右) SARS-CoV-2 S 発現偽型 HIV-1 ウイルスの中和。 技術的重複の平均値が表示されます。 (c) (b) のサンプルの WH1 S シュードウイルス NT50 力価。 枯渇後の NT50 は、FLAG 枯渇画分の抗 RBD Strep 力価をインプットと抗 RBD FLAG の力価を等しくする補正を適用することにより、BA.1 RBD ELISA 力価 (a) に基づいてインプット血清に対して正規化されました。 -インプットに対するStrep-枯渇画分の力価。 P 値は、片側対応 T 検定の値です。 FC、フォールドチェンジ。 (d) WBBレジメンによる過剰なBA.1中和に対するde novo抗体と記憶由来抗体の寄与の推定。 BA.1 ブースティングによる交差反応性メモリー B 細胞の二次親和性成熟または優先的選択の寄与、ΔS は、Strep+ WBB と総 WWW BA.1 中和力価の差として計算されます (後者はすべて FLAG+ であると想定されます)。 BA.1 ブースティングによって新たに誘導された BA.1 特異的抗体の寄与、F は、FLAG+ WBB 力価として与えられます。 WBB における BA.1 中和の改善に対する F の寄与率は、(F/(F + ΔS))*100 として計算されます。 棒と点線は、F と ΔS の計算に使用された各条件の中央値を表します。 上の点線 (4.) は、総 WBB 抗体の中和中央値を表しており、参考目的のみに示しています。 グループ 1 と 4 のデータは図 4b から再現され、グループ 2 と 3 のデータは図 4h から再現されます。

(a) 上: 単一酵母細胞を選択するためのすべての実験に使用されるネステッド FACS ゲーティング戦略の代表的なプロット。 下: RBD 発現単一細胞を選択するためのゲーティング戦略 (FITC-A 対 FSC-A)。 （b）APC結合ストレプトアビジンまたはAPC結合ストレプトアビジンによる二次染色によって測定された、Strep抗体またはFLAG抗体結合が低下したBA.1またはWH1 RBD変異体を発現する細胞（青色の細胞）を選択するための2つの独立したライブラリのうちの1つに対するFACSゲーティング戦略抗FLAG抗体。 RBD 発現の程度に応じてタグ付き抗体の結合量が減少した細胞を捕捉するために、各サンプルに対してゲートを手動で設定しました。 FACS 散布図は、2 つのライブラリ間で定性的に類似していました。 マウス識別子 (#1 ～ 4)、DMS ターゲット ライブラリ (WH1 または BA.1)、および抗体タグ (Strep または FLAG) が各プロットの上に示されています。 (c) 2 つの独立した生物学的複製ライブラリー間のエスケープ スコアの変異 (左) および部位 (右) レベルの相関。

3回目の投与から2週間後に、4匹の異種免疫マウスから採取した血清の深部突然変異スキャン結果（図4d）。 各変異の「エスケープ率」を測定しました。値の範囲は、0 (抗体結合に対する細胞の影響なし) から 1 (変異のあるすべての細胞の抗体結合が減少) です。 マウス 4 は、いずれの抗体画分についても BA.1 ライブラリーに結合する抗体に解釈可能なピークがなかったため、本文には示されていません。 ロゴプロットは、強力なエスケープの主要な部位における個々のアミノ酸変異の抗体エスケープ率を示します。 BA.1 が WH1 配列と異なる部位は紫色のフォントで示されています。 すべてのエスケープ スコアは補足表 1 に示されており、https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_OAS/blob/main/results/supp_data/all_raw_data.csv でオンラインで入手できます。

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転載と許可

Schiepers、A.、van't Wout、MFL、Greaney、AJ 他。 反復免疫に対する血清抗体応答の分子運命マッピング。 Nature 615、482–489 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-05715-3

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受信日: 2022 年 8 月 29 日

受理日: 2023 年 1 月 6 日

公開日: 2023 年 1 月 16 日

発行日: 2023 年 3 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05715-3

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