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Jan 06, 2024

脂質とNBS変性ABCトランスポーターの非対称ダイナミクスの間の相互作用について

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 149 (2023) この記事を引用

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多剤耐性関連タンパク質は、ABC C ファミリーのエクスポーターです。 これらは膜を越えてさまざまな基質を輸送するため、薬理学において非常に重要です。 しかし、縮重ヌクレオチド結合部位 (NBS) の役割は、周囲の脂質環境との相互作用と同様に不明のままです。 ここでは、約 10 年の MRP1 の動的および構造の概要を提案します。 110 μs の分子動力学シミュレーション。 NBS1 への ATP 結合は、おそらくいくつかの輸送サイクルにわたって維持されます。 NBD の非対称挙動は、NBD1 と結合ヘリックスの間にボール アンド ソケット構造が存在しないため、NBD1 からタンパク質の残りの部分へのシグナル伝達が低下することによって確保されます。 周囲の脂質が基質結合ポケットとNBDの間のアロステリック伝達において積極的な役割を果たしているにもかかわらず、我々の結果は、脂質組成の影響は限定的であり、主に輸送動態に影響を与えることを示唆している。 私たちは、私たちの研究を他の縮重NBS ABCタンパク質にも拡張することができ、ABCトランスポーター間の機構の違いを解読するためのヒントを提供できると信じています。

ATP 結合カセット (ABC) トランスポーターは、最大のトランス界タンパク質スーパーファミリーの 1 つに属します。 いくつかの ABC トランスポーターの構造解決により、異なる立体構造 (つまり、内向きの IF、外向きの OF、閉塞) が得られ、交互アクセスが輸送サイクルに沿った基質の移動を合理化する最も可能性の高いモデルであることが示されています 1。 2、3。 ABC トランスポーターの構造は、6 つの膜貫通ヘリックス (TMH) からなる少なくとも 2 つの膜貫通ドメイン (TMD) で構成されています。 TMD は、種を超えて進化的に保存されている 2 つのヌクレオチド結合ドメイン (NBD) に結合しています。 ABC 輸送サイクルには、2 つの ATP 分子の結合と、そのうちの少なくとも 1 つの加水分解から放出されるエネルギーが必要です3、4、5、6、7。 ATP 分子は、非共有結合による疑似対称の頭から尾への配置を採用する NBD 二量体の界面で結合します。 2 つのヌクレオチド結合部位 (NBS) の形成が可能になります。 両方の NBS は、保存されたウォーカー A および B モチーフ、一方の NBD の A、Q、および H ループ、およびもう一方の NBD4、5、7、8 の ABC シグネチャー配列と X ループによって形成されます。

少数のメンバー (すなわち、CFTR、ABCA4、ABCD4、SUR1/2)2、3、9、10 を除いて、真核生物の ABC トランスポーターはエクスポーターです。つまり、基質を細胞外コンパートメントに押し出します。 真核生物のABCトランスポーターは、かつてはI型（ABCB、ABCC、ABCD）とII型（ABCA、ABCG）ファミリーに分類されていました。 最近、ABC トランスポーターの構造的および機能的多様性により、以前のタイプ I およびタイプ II エクスポーターがそれぞれタイプ IV および V フォールディングを採用する、新しいフォールディングに基づく分類 2,3 が導入されました。

多剤耐性関連タンパク質 (MRP) は、NBS 変性 ABC トランスポーターです 3、4、5、7、8。 非標準的な NBS1 では、ウォーカー B 触媒グルタミン酸、A ループ チロシン、ABC シグネチャ モチーフの最初のグリシン残基が、それぞれアスパラギン酸、トリプトファン、バリン残基に変異しています。 これらの変異は、変性 NBS に対する大幅に低い ATPase 活性と高い ATP 結合親和性と関連していました 14,7。 これらの観察は最近、トランスポーター全体のダイナミクスと機能に影響を与える可能性のある NBD 機能の新しい非対称モデルの開発につながりました 3,7。 ウシ ABCC1/MRP1 (bMRP1) の機能と動態は、低温電子顕微鏡 (cryo-EM) 実験と単一分子フェルスター共鳴エネルギー移動 (smFRET) からの構造情報を組み合わせることにより、広範囲かつ徹底的に研究されました。 bMRP1 構造の解明によって得られた確固たる洞察にもかかわらず、bMRP1 実験に使用された非ネイティブ界面活性剤ベースの環境が部分的に原因として、ABCB エクスポーターと ABCC エクスポーターとの間に説明のつかない差異が観察されました 7,11。

ABC トランスポーターは、生体異物や内因性化合物などの非常に多様な基質を細胞膜を越えて輸送することにより、薬理学において重要な役割を果たしています。 例えば、それらの薬理学的役割は、医薬品開発において新しい生体異物との相互作用を調査する必要がある「新たな臨床的重要性」のトランスポーターのリストを作成している国際トランスポーターコンソーシアム（ITC）によって強調されている12。 過去数十年にわたり、MRP が含まれる ABCC トランスポーターは、治療に対する患者の個体間の反応を含む薬理学における役割により、関心が高まっています。 たとえば、ABCC2/MRP2 および ABCC4/MRP4 に関する調査は、薬物動態に関する臨床観察のメカニズムを遡及的に説明するために ITC によって推奨されています 13。 局所薬物動態および薬力学関係 (PK/PD)、ひいては局所薬物バイオアベイラビリティにおける MRP の役割を考慮すると、生体異物膜通過事象の包括的な概要を提供するために、現場での MRP 輸送サイクルを解読する必要が依然としてあります。 腎臓と肝臓は世界中で使用されているほとんどの生体異物の除去に関与しているため、これは近位尿細管腎細胞と肝臓肝細胞に存在する MRP に特に関係があります 15。

残念ながら、ヒト MRP の構造はまだ実験的に解明されていません。 MRP4 構造を貫通する MD 精製されたタンパク質が提案されていますが、計算分解能のせいで機能研究や徹底的な構造力学が不可能です。 しかし、bMRP1 トランスポーターのいくつかの立体構造は、cryo-EM4,5,8 によって解明されています。 ヒトオルソログ hMRP1 (91%) および他のヒト MRP 内との高い配列類似性 (約 40 ～ 50%) を考慮すると、プロトタイプとして bMRP1 構造を使用することは、MRP トランスポーターの動態と機能を調査するのに適切であると思われます 3。 MRP1 エクスポーターはタイプ IV 折りたたみを採用しています。 ただし、5 つの TMH からなる追加の N 末端 TMD があります。 いわゆる TMD0 は、ABC ATPase 活性にも基質輸送にも役割を果たしていないことが示されています 3,4,8。 したがって、TMD0 のない MRP1 モデルは、このドメインを持たない ABCC エクスポーター (MRP4 など) のプロトタイプとして使用できます。 TMD0 は、トラフィッキングと機能の両方に必須であることが示されているリンカー (L0) によって従来の ABC TMD に接続されています 8,17。 L0 配列は、TMD08 が存在しない場合でも、ABCC サブファミリーのすべてのメンバーで保存されています。 現在のモデルには TMD0 が含まれていないため、この原稿では ABC タイプ IV の標準的な TMH ラベル、つまり TMH1 から TMH12 が使用されることに注意することが重要です。

本研究は、非対称性の重要性を強調しながら、さまざまな結合状態（つまり、IF 立体構造の場合はアポ、ATP および/またはロイコトリエン C4-LTX - 結合状態 8、OF 立体構造の場合は ATP 結合状態 4）を考慮して、MRP1 の ABC 立体構造空間 1,18 をマッピングすることを目的としています。 ABC ドメイン内。 さらに、ABCC 輸送サイクルにおける周囲の脂質の重要性を考慮して 11,19、脂質二重層とタンパク質の動態の間の相互作用も調査されました。 これは、(i) 純粋な POPC (1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)、(ii) 純粋な POPE (1-パルミトイル-2-オレオイル-sn) で構成されるさまざまな計算対称膜モデルを使用することによって達成されました。 -グリセロ-3-ホスホエタノールアミン)、(iii) POPC:POPE (3:1)、(iv) POPC:Chol (3:1)、および (v) POPC:POPE:Chol (2:1:1)。 後者は、現場の MRP1 ダイナミクスを模倣するのに最も近いものです。 この目的に対処するために、全原子のバイアスのないマイクロ秒スケールの分子動力学 (MD) シミュレーションが実施されました。

bMRP1 の結合状態を説明する POPC:POPE:Chol (2:1:1) のシミュレーション中にサンプリングされた立体構造空間を調べるために、以前の研究 1、11、18 に従ってさまざまな構造記述子が考慮されました。 つまり、TMDについては細胞内（IC）および細胞外（EC）角度が監視され、NBDにはNBD距離とNBDロッキングツイスト角度が使用されました（図1および補足図1〜6）。 後者は、ABCB1/P-gp18 の OF から IF への移行に沿って適応することが知られています。 これらの構造記述子は、ABC 立体構造空間 1,18 を再構築するために、bMRP1 クライオ EM 構造 4,5,8 を含む実験的に解決された ABC タンパク質の大規模なデータセットでも測定されました 1,18 (図 1d および補足表 1)。 既知の ABC 構造、つまり IF オープンおよびオクルーデッド、OF、および最近解明された非対称ロック解除 (UR) ターンオーバー 1 構造が効率的に特徴づけられました。 bMRP1 MDシミュレーションにより、結合状態や膜組成に関係なく、すべてのIFシステムの細胞内腔が自発的に閉じることが明らかになりました（図1a、b、補足図1〜6、および補足表2〜5）。 平均 NBD 距離と IC 角度は、bMRP1 クライオ EM 構造について計算されたものよりも大幅に小さかった。 たとえば、IFコンホメーションは、それぞれ26.0±0.5〜35.4±1.8°および30.3±1.9〜55.0±2.8Åの範囲の同様のIC角度とNBD距離値に収束しました（図1b、補足図1、3〜4、および補足表 3 ～ 4)。 興味深いことに、NBD の自発的な二量体化は、ATP 分子の非存在下でも観察されました。 シミュレーションとクライオ EM 構造の違いは、実験での非ネイティブ界面活性剤の使用によって部分的に説明される可能性があります 7,11。 実際、bMRP1の分解されたクライオEM構造は、ネイティブ環境で分解された他のABC構造よりも大きなIC角度とNBD距離を示しました（図1d）。 脂質二重層膜の細胞外側では、OF bMRP1-(ATP)2 の MD シミュレーションでは、bMRP1 OF クライオ EM 構造と比較して EC ゲ​​ートの小さな開口部が示され、わずかに開いた状態の存在が示唆されました。 ただし、計算された EC 角度は小さいままであり (POPC:POPE:Chol (2:1:1) では 20° 未満、図 1a、補足図 1 ～ 2、および補足表 2 を参照)、これにより基質の再突入が妨げられます 1 。

内向き立体構造: アポ状態 (IF apo bMRP1)、基質結合 (bMRP1-LTX)、ATP 結合 (bMRP1-(ATP)2)、ATP/基質結合 (bMRP1-LTX-(ATP)2) ; 外側を向いた立体構造: ATP 結合 (OF bMRP1-(ATP)2)。 a MD シミュレーションの開始時と終了時に調査された、さまざまな bMRP1 システムの代表的なスナップショット。 b IF 構造と OF 構造のそれぞれの IC 角と EC 角の時間発展。 IC 角と EC 角は、方法セクション 1、11、18 で定義された提案された ABC 構造パラメータに従って計算されました。 c ウォーカー A グリシンと ABC 署名セリン残基の間の NBD 間距離によって定義される主要な NBS 距離の時間発展 8。 d 複数の解決されたABC構造から得られたABC立体構造空間へのbMRP1構造パラメーターの投影。 結果は各システムの n = 3 MD 軌跡から得られ、標準偏差が示されています。 解決された bMRP1 クライオ EM 構造の PDB ID が明示的に記載されています。 第 1 と第 2 の TMD はそれぞれオレンジと青で描かれており、NBD1 と NBD2 はそれぞれ黄色とシアンで色付けされています。

転座前の状態（すなわち、bMRP1-LTX-(ATP)2）で実行された軌跡は、OF構造のABC構造部分空間に存在する傾向がありますが（図1d）、基質の転座は観察されませんでした。 bMRP1-LTX-(ATP)2状態について計算されたNBDツイスト値は、OF ABC立体構造と類似しています。 ただし、NBD 距離は、解析された基板を含まない OF ABC 構造および OF bMRP1-(ATP)2 シミュレーションよりも大きいままです。 ABC シグネチャーモチーフのセリンとウォーカー A グリシンの Cα 原子間の距離をモニタリングしました (つまり、Gly681-Ser1430 および Ser769-Gly1329、それぞれ \({d}_{{GS}}^{{NBS}1}\ と表記) ) および \({d}_{{GS}}^{{NBS}2}\)、図 1c、補足図 7–8)。 転座前と転座後の状態の間の構造の違い（すなわち、それぞれ bMRP1-LTX-(ATP)2 および OF bMRP1-(ATP)2）は、基質転座イベントの前に NBD 二量体の立体構造転移が必要であることを示唆しています。 。 いわゆる「非コンピテント」から「コンピテント」な NBD 二量体立体構造へのこのような転移は、TMD 立体構造転移を引き起こす可能性があり、これが IF から OF への転移の制限段階である可能性を示唆しています。

bMRP1の立体構造は、TM細孔の開口部に基づいて文書化することもできます（補足図9〜13）。 予想どおり、TM 細孔は、上部リーフレット（脂質二重層中心の z = 18 および 5 Å 上、補足図 10-11）の OF bMRP1-(ATP)2 の方が大きい一方で、IF 立体構造は閉じたままです。 興味深いことに、IF コンフォメーションでは 5 Å でボトルネック形状が観察されました。 下葉のTM半径プロファイルで観察された動的変動にもかかわらず、開口に関して次の順序が観察されました（補足図12〜13）：IF apo bMRP1 > IF bMRP1-(ATP)2 > IF bMRP1-( LTX) ≈ IF bMRP1-LTX-(ATP)2 > OF bMRP1-(ATP)2。 これは、bMRP14,5を含むABCトランスポーター18のTMバンドルに結合することが示された基質の役割と一致しています。 MD シミュレーションの初期段階で急速に減少する傾向がある IC 角度と NBD 距離とは対照的に、脂質二重層の選択された深さでの TM 細孔半径はシミュレーション中比較的一定のままです。

全体的な柔軟性は、二乗平均平方根変動を計算することによって評価されました（RMSF、補足図14）。 残基ごとの RMSF は、NBD7 の非対称挙動を確認し、NBD2 は NBD1 よりも柔軟です。 各システムについて、バックボーンベースの主成分分析 (PCA) が実行されました。 最初に最大の 3 つの主成分のみが考慮され、システムに応じて全体の構造変動の 85.6% ～ 95.9% が明らかになりました (補足図 15)。 すべてのIFシミュレーションで、最初の3つの最大の変動は、NBD2が動きの27.0〜59.6％に最も寄与した非対称NBD動きに体系的に割り当てられました（補足図16）。 最初の主成分は主に NBD のツイストとロッキング動作に割り当てられました (補足ムービー 1 ～ 5)。 これは、MRP15の運動サイクルに沿ったsmFRET実験から実験的に示唆されたNBDのより高い柔軟性と一致する。 OF シミュレーションに関しては、2 つの最初の主成分は、主に TMH4、TMH5、TMH7、TMH8 によって媒介される協調的な NBD ねじれ運動と細胞外側の開口に関連していました。 これらの TMH は、ABCB1/P-gp18 内で単一のバンドルとして動作することが示唆されています。 さらに、IF コンホメーションほどではありませんが、NBD2 は NBD1 よりもこの共有運動に関与したままでした。

非対称挙動は、アポ、bMRP1-(ATP)2およびbMRP1-LTX状態について2つの主要な部分集団が観察されたNBD1とNBD2の間の超分子配置によっても描写されました（図2a）。 興味深いことに、ATP 分子が存在しない場合でも、NBD を越える NBS 内の相互作用は MD シミュレーションに沿って維持されました。 2 つの NBD 立体配座が観察され、非対称的に開いた NBD ダイマー配置と閉じた NBD 二量体配置のいずれかが観察され、後者が有利でした。 驚くべきことに、ATP 分子が NBD 二量体界面で相互作用を維持すると予想されていたにもかかわらず、bMRP1-(ATP)2 では両方の配置も観察されましたが、その程度はより低かったです。 基質分子と ATP 分子の両方が存在する場合、TMD 基質結合ポケットから NBD への情報伝達を示す閉鎖集団のみが観察され、IV 型フォールディング ABC トランスポーターにおける IF から OF への移行のエネルギー障壁が減少すると考えられます 20。 21.

a MD シミュレーション中に観察された NBD 二量体の開いた立体構造と閉じた立体構造を示す代表的なスナップショット。 IF apo bMRP1、bMRP1-(ATP)2、および bMRP1-LTX により、黒い矢印が動きを強調している 2 つの主要な部分集団が明らかになりました。 一方、転座前および転座後の立体構造（すなわち、bMRP1-LTX-(ATP)2およびOF bMRP1-(ATP)2）は、閉じたNBD二量体立体構造のみを示しました。 NBD1、NBD2、および結合ヘリックスはそれぞれ黄色、シアン、ピンクで示されています。 b InfleCS 法で開発された GMM ベースのアプローチから得られたシステム依存の局所構造ランドスケープ 23,64 は、bMRP1 の構造動態に対するヌクレオチドと基質の影響を強調しています。 c ヌクレオチドとNBS1およびNBS2の間で個別に計算された平均クーロンおよびファンデルワールス電位（各レプリカに800ポイントを使用し、独立して処理しました。エラーバーは標準偏差を示します）。 d ATPとNBS1またはNBS2の間、およびLTXと基質結合ポケット残基の間の計算された水素結合ネットワーク（水素結合画分は各レプリカから独立して計算され、n = 3で平均されました。エラーバーはそれらの標準偏差を示します）。

NBD の非対称挙動を説明するために、TMD から NBD へのシグナル伝達を確実にするカップリングヘリックス (CH) に特に注意が払われました 20,21。 本来、ABC トランスポーターは、TMH2/TMH3、TMH4/TMH5、TMH8/TMH9、および TMH10/TMH11 の細胞内ドメインを連結する 4 つの結合ヘリックスを示します。 いわゆるCH2-3とCH10-11はNBD1と接触しており、CH4-5とCH8-9はNBD2と相互作用しています（図2a）。 CHとNBDの間の接触は、ATP分子または基質の結合によって変更されません（補足図17）。 興味深いことに、特定の NBD について、少数のコンタクトのみが観察された、いわゆる「弱い CH」(つまり、NBD1 と NBD2 ではそれぞれ CH2-3 と CH8-9) を考慮できます。 一方、いわゆる「強い CH」（つまり、NBD1 と NBD2 のそれぞれ CH10-11 と CH4-5）は、NBD との接触が多く、「ボールとソケット」の配置が顕著でした。 「弱いCH」よりも顕著です。 興味深いことに、哺乳類のMRP1では、NBD1配列は13アミノ酸の欠失を示し、これはNBD2のCH4-5およびCH8-9と比較して、CH2-3とCH10-11の間の接触が少なく、相互作用が著しく弱いことに関連しています（補足図18）。 ）。 さらに、CH2-3 と CH10-11 の間で観察されたいくつかの接触は、ATP 分子の存在下でわずかに減少しますが、NBD2、つまり CH4-5 と CH8-9 の接触パターンは、ATP および /またはロイコトリエンC4。 これは、NBD1 の CH2-3 と CH10-11 のいわゆる「ボールとソケット」配置の破壊につながり、(i) 前述の NBD 非対称開口部の原因となり、(ii) 非対称開口部の原因となると予想されます。 TMDとNBD18の間の情報伝達。

IF 立体構造は、OF 立体構造よりも弱い NBD 二量体相互作用を示し、全体的により大きな柔軟性を説明しています。 同様に、MD シミュレーションでは、ATP および/または LTX 結合システムと比較して、IF アポ状態の柔軟性がわずかに高いことが明らかになりました。 これは、TMH 間または NBD 間の相互作用が基質および/または ATP 分子の存在によって調節されることを示唆する以前の観察と一致しています 4、7、8、22。 私たちの広範な不偏 MD シミュレーションを利用して、InfleCS クラスタリング手法 23 を使用して、探索された構造部分空間を自由エネルギーの観点から特徴付けました (図 2b)。 前述の非適格な NBD 二量体立体構造を考慮して、NBD 構造パラメーター、つまり NBD ねじれと NBD 距離に焦点が当てられました。 IF コンフォメーションのより大きな変動が観察され、相互変換は可能ですが遅い複数のもっともらしい最小値が生じます。 有能であると予想される NBD ツイスト対 NBD 距離部分空間は、ATP 分子および/または基質の存在下で構成される傾向があります。 このような発見は、ABCC1輸送サイクルにおけるATP結合イベントと基質結合イベントの中心的な役割を強調している。 NBDダイマーのダイナミクスをよりよく解読するために、コンタクトマップ（補足図19）と動的相互相関行列（補足図20）の両方を考慮することによって構造ネットワーク24が得られました。 各 NBD は、ATP 結合によって駆動される立体構造や結合状態に関係なく、グローバルに 2 つのサブドメインに分割できます (補足図 21)。 実際、同様のいわゆるコミュニティは、調査されたレプリカおよびシステム全体で比較的よく保存されていました (補足表 6)。 最初のコミュニティは、ウォーカー A と B、および A ループと H ループによって定義されます。 一方、2 番目のコミュニティには、Q ループと X ループ、および ABC 署名シーケンスが含まれます。 これらのコミュニティに関与する残基は高度に相関しており、ATP 結合時の局所的な残基置換が伝播することを示唆しています。 2 つのコミュニティはほぼ独立していると考えられます。 したがって、1 つの ATP の結合が 2 番目のコミュニティの動きに強い影響を与えるとは予想されません。 一方、NBD の非対称二量体配置を考えると、ATP とマグネシウムは NBD 間のコミュニティを結び付けると期待されます。 興味深いことに、IF apo シミュレーションにおける動的相関は、コミュニティがサブコミュニティに分割される可能性があるため、より大きなばらつきを示しました (補足表 7)。そのため、ATP 結合は NBD 内および NBD 間の構造的協力を強化すると予想されます。

ファンデルワールスとクーロンポテンシャルおよびNBSの水素結合ネットワークを評価することにより、ATPの結合モードに特に注意が払われました（図2c、d）。 このような分析は、特に短距離では 2 つの電位間の誤差を補正するため、定量的に考慮すべきではありません 25。 ただし、ATP 結合の推進力を比較するための定性的なヒントを提供するために使用できます。 興味深いことに、クーロン相互作用と分散相互作用はいずれも、すべての IF 配座に対して OF 配座よりも誘引力の低いエネルギーを示しました。 NBD が OF 立体構造において低い柔軟性を示すことを考えると、その後のより緊密な NBD 二量体相互作用は、NBS 内の ATP 分子の適切な局所配置によって合理化できます。 たとえば、ATP分子とNBS保存モチーフの間で計算された低いπスタッキング距離は、OF立体構造よりもIFの方が系統的に大きく、ATP分子とMRP1残基間の相互作用エネルギーが低くなりました（図2cおよび補足表8）。 驚くべきことに、IF立体構造では、NBS1は、NBS2 AループのTyr1301と比較して、ATP分子とTrp653 Aループ残基との間の分散性相互作用が低い傾向にある一方、トリプトファンの空間芳香族表面はチロシンよりも大きい。 一方、OF 配座では、分散寄与は NBS2 よりも NBS1 の方がわずかに大きくなる傾向があります。 ATP分子とNBSの間の水素結合ネットワーク（図2d）は、IF立体構造についてのNBS間の同様のネットワークを示唆しています。 水素結合ネットワークは、ウォーカー A との相互作用に関して IF および OF 配座にわたって保存されています。 ただし、ATP 結合 IF システムは、OF シミュレーションで観察されたようなシグネチャ モチーフを伴う予想される H 結合ネットワークを示しません。 興味深いことに、MD シミュレーションは、Q ループ グルタミン残基、つまり NBS1 と NBS2 それぞれの Gln713 と Gln1374 との水素結合に関して、NBS 間の非対称挙動を示唆しています。 計算された距離は、NBS1 Q ループへの ATP γ-リン酸の結合が、OF 立体構造の NBS2 よりも弱いことを示唆しました。 IF コンフォメーションの MD シミュレーションでは、逆の挙動が観察されました。 したがって、今回のシミュレーションは、両方の NBS における適切な ATP 結合モードが、基質の転座に必要な構造変化を引き起こす鍵であることを強調しています。

基質結合ポケットに特に注目し、ロイコトリエン C48 に結合した bMRP1 のクライオ EM 構造と比較しました。 実験と一致して、ロイコトリエン C4 結合モードは 2 つのいわゆる P ポケットと H ポケットで発生しました (「P」と「H」はそれぞれ極性と疎水性を表します)。 ロイコトリエン C4 の両親媒性の特徴を考慮すると、クーロン結合ネットワークと水素結合ネットワークが基質結合の中心であることが示されています 8。 MDシミュレーションでは、実験で観察されたものと同じ重要な残基が強調されました（図2d）。 例えば、アルギニン残基（Arg1248、Arg1196、およびArg593、図2dおよび3a）間に強い塩橋が観察され、Pポケット内の3つのロイコトリエンカルボン酸基のうち少なくとも2つが維持されています。 興味深いことに、H結合の割合または相互作用エネルギーに関する変動（図2dおよび補足図22）は、IFからOFへの大規模な構造変化に沿った予想される破壊と一致する動的結合モードを示唆しています。

基質結合ポケットは、ロイコトリエン C4 結合にとって重要な残基を強調表示します。 両親媒性の特徴が強調されたロイコトリエンの構造も示されています。 b NBS1 と NBS2 を別々に処理した本研究で調査されたアロステリック経路の定義。 c POPC:POPE:Chol (2:1:1) に埋め込まれたさまざまなシステムの、基質結合ポケットと NBS1 (赤) または NBS2 (青) の間の情報の流れのアロステリック効率を計算しました。 実線、破線、点線はそれぞれ、タンパク質 + 脂質 + ヌクレオチド/基質、タンパク質 + ヌクレオチド/基質、およびスタンドアロンタンパク質を考慮した効率を示しています。 標準誤差は色合いとして示され、各システムで独立して処理された n = 3 個のレプリカから計算されました。 d 基質結合ポケットからNBS1およびNBS2へのアロステリック通信の情報の流れに対するタンパク質と脂質の寄与は、NBD2とその結合ヘリックス（CH4-5およびCH8-9）がシンク領域に関係なく体系的に関与していることを示しています。

bMRP1-LTX-(ATP)2とbMRP1-LTXまたはbMRP1-(ATP)2の間の相互作用エネルギーおよび水素結合ネットワークの違いは依然として低いままであったが、それらはNBSと基質結合ポケットとの間の遠隔効果を示唆している。 アロステリック効果は、基質結合ポケットとNBS1およびNBS2の間で独立して評価されました（図3b）。 これは、アロステリック経路ネットワーク分析のための各結合部位の重要な残基 (補足表 9) を考慮することによって達成されました 26,27。 効率（図3c）は、基質およびATP分子の存在下または非存在下で計算されました。 POPC:POPE:Chol (2:1:1) 脂質二重層の影響も考慮されました。 ヌクレオチドや基質を含まずに計算された効率によって示されるように、本来、基質結合ポケットと NBS はタンパク質を介してアロステリックに結合しています。 予想通り、基質および/または ATP 分子の存在により、基質結合ポケットから両方の NBS へのアロステリック伝達が実質的に増加しました。 興味深いことに、前述の NBD の非対称ダイナミクスにもかかわらず、現在の計算では NBS 間の効率に関して有意な差は示されませんでした。 アロステリック経路への残基とドメインの寄与を描くために、中間性を計算しました（図3dおよび補足図23〜25）。 ATP結合システム、すなわちIF bMRP1-(ATP)2、およびbMRP1-LTX-(ATP)2、ならびにOF bMRP1-(ATP)2に特に注意が払われました（図4d）。他のシステムはで報告されています。補足図26。結合ポケット-NBSアロステリック経路に関与する主な残基は、ほとんどがTMHの細胞内部分に位置しています。 興味深いことに、TMH4、TMH5、TMH7、および TMH8 が TMH1、TMH2、TMH10、および TMH11 よりも著しく関与している非対称挙動が再び観察されました。 bMRP1は、いわゆる「ボールアンドソケット」配置に関して非対称な特徴を示し、これは結合ヘリックスを介したTMHとNBDの間の構造的協力に関与していることが示されています8。 NBD1 の 13 個のアミノ酸の欠失により、TMH1、TMH2、TMH10、および TMH11 と NBD1 との間の連携が低下し、その結果、基質結合ポケットと NBS1 の間のアロステリック伝達が減少します。 さらに、CH10-118 には「ボールとソケット」構造が存在しないため、NBD1 との直接通信が大幅に弱められるため、情報はほとんど NBD2 を経由することが我々の計算から示唆されています。 興味深いことに、POPC:POPE:Chol脂質二重層は、基質結合ポケットとNBSの間のアロステリックコミュニケーションにおいて重要な役割を果たすことも示されました（図3c）。 しかし、その影響は大きいにもかかわらず、脂質二重層の寄与は、例えばメジャーファシリテータースーパーファミリー膜トランスポーターよりも穏やかであるように見えた28。

a 状態および脂質二重層ごとの n = 3 MD 軌道から計算された、さまざまな脂質二重層に埋め込まれたすべての bMRP1 システムの平均 IC 角度、EC 角度、および NBD 距離。 エラーバーは、各データセットの標準偏差を指します。 b POPC ベースのモデルに組み込まれたすべてのシステムのパルミチン酸テール (sn1) およびオレイン酸テール (sn2) の C 原子脂質テール オーダー パラメーター (SCD) を計算しました。 実線、破線、点線はそれぞれ、POPC:POPE:Chol (2:1:1)、POPC:Chol (3:1)、POPC 脂質二重層モデルで得られた脂質秩序パラメーターを示しています。 エラーバーは、計算された各データセットの標準偏差を指します。 c 各レプリカを個別に考慮して、n = 3 の MD 軌道を平均することによって得られた膜自由エネルギー変形 30 の計算値。 生データは補足表 10 ～ 12 で入手できます。 エラーバーは、3 つの独立したレプリカにわたる標準偏差を指します。 d コレステロールおよびPE脂質からそれぞれ80％および50％より高い存在確率によって定義される、コレステロールおよびPE脂質から得られた計算された結合ホットスポット。 Cryo-EM で分解されたコレステロール (紫) を拡大すると、脂質二重層に対する特定の平行配向が強調表示されます。 e アロステリック経路分析に基づく重要な脂質領域。 基質結合ポケットと NBS の間のアロステリック伝達に関与する重要なコレステロール分子の位置が示されています。 両方の NBS が考慮され、bMRP1 機能に有利な可能性がある特定の脂質タンパク質相互作用における L0、プレ TMH1 およびプレ TMH7 領域の予想される中心的役割が強調されます。

現在、周囲の脂質環境 11、19、22、26、28 と膜タンパク質の間の相互作用に注目が集まっているため、脂質依存性タンパク質の動態および脂質タンパク質相互作用が研究されています。 これは、異なる脂質二重層、つまり POPC、POPC:Chol (3:1)、POPC:POPE:Chol (2:1:1) で MD シミュレーションを実行することによって達成されました。 IF apo bMRP1 および OF bMRP1-(ATP)2 システムは、非現実的な POPE および POPC:POPE (3:1) 脂質二重層でも考慮されました。

脂質依存構造パラメーターをABC立体構造空間に投影したところ（補足図1、27、28）、現在のシミュレーションのほとんどは、脂質二重層膜の組成に関係なく、同様のABC部分空間を探索する傾向があることが明らかになりました。 図 4a は、本研究で実行されたすべての MD シミュレーションの脂質二重層組成に応じた構造パラメーターの平均を比較しています。 IF立体構造の場合、細胞内構造パラメータ(すなわち、IC角度およびNBD距離)のみが、脂質組成に応じてわずかな偏差を示した。 純粋なPOPC脂質二重層で実行されたシステムは、わずかに開いた立体構造を示しました。 一方、我々の計算は、EC 角度のみが脂質二重層組成の影響を受けるが、OF 立体構造の場合のみ影響を受けることを示唆しています。 同様に、計算された空洞半径（補足図9）は、脂質二重層組成を比較する際に小さな差異を示しました。 これらの計算は、さまざまな脂質二重層モデルで bMRP1 構造を比較しながら、膜組成の比較的限定された全体的な影響を強調している場合でも、MD シミュレーションとレプリカにわたる動的変動を十分に描写していませんでした（補足図1〜6および9）。

脂質依存性の立体構造を計算しました（補足図２９および３０）。 特定の立体構造と結合状態について、MD シミュレーションでは、脂質組成に関係なく、類似した領域が優先的に配置されました。 しかし、構造の変動性は脂質組成によって大きく影響されることが示されました。 たとえば、純粋な POPC 脂質二重層では、NBD 距離が 30 ～ 55 Å の範囲の、より開いた IF 立体構造サブスペースがサンプリングされました。 しかし、この効果は、TMH間の接触をより多く維持し、したがって細胞内の開口部を減少させる傾向があると予想される基質の存在下では減少しました。 POPC:POPE:Chol (2:1:1) で実行された MD シミュレーションでは、サンプル領域が大幅に小さくなったことが示されました。これは、結合状態に関係なく、PE 脂質の存在が bMRP1 IF 立体構造の細胞内ゲートを閉じる傾向があることを示唆しています。 一方、OF 立体構造と細胞外開口部に関しては、興味深いことに、純粋な POPC および POPC:Chol (3:1) で実行した MD シミュレーションと同じ立体構造空間の同じ部分空間でグローバル ミニマが観察されました。 これは、bMRP1 EC ゲ​​ートの開口に対するコレステロールの影響が限定的であることを示唆しています。 ただし、PE 脂質の存在により、計算された最小値は、13.9 度から 18.5 度へと、より開いた OF 構造に向かってわずかにシフトしました。 異なる脂質二重層組成間のわずかな違いを明らかにするために、TMHと脂質二重層法線の間の傾斜角を測定しました（補足図31）。 これらの分析から明確な結論は導き出せませんが、TMH3、TMH6、および TMH9 の配向は、コレステロールが存在しない場合により敏感であるようです。 ABCB1 / P-gp18に示されているように、TMHがバンドルとして機能することを考慮すると、脂質二重層膜の影響は、特定のより小さいバンドル（補足図32）、つまりそれぞれTMH3/で構成されるバンドルCおよびDの傾斜方向に対してより顕著でした。 TMH6とTMH9/TMH12。 興味深いことに、これらの束は輸送サイクルに沿ってより大きな構造変化を受けると予想されます 18。 これは、異なる脂質二重膜の bMRP1 ローカルミニマの構造を比較する際に脂質組成が与える影響はかなり限定的であるように見えますが、脂質組成は立体構造遷移に影響を及ぼし、したがって基質の動態に役割を果たすことが期待されることを示唆しています。 bMRP1による輸送。

脂質二重層と bMRP1 の間の相互作用をよりよく理解するために、脂質二重層の膜構造に特に注意が払われました。 純粋なPOPC膜におけるより大きな構造変動は、パルミチン酸塩尾部とオレイン酸塩尾部の低次パラメーター（SCD）によって示される、著しく流動性の高い脂質二重層構造によって説明されました（図4b）。 純粋な脂質二重層の生物物理学と一致して、コレステロールの存在は脂質の秩序を高めることによって POPC の流動性を調節し、その結果、脂質二重層膜の柔軟性が低下します 29。 程度は低いが、PE脂質の存在はコレステロールの構造効果を増強し、これはPOPC:POPE:Chol(2:1:1)におけるbMRP1の構造変動性が他の脂質二重膜と比較してわずかに低いことと一致している。 脂質の秩序計算は、脂質二重層構造に対するタンパク質の動態の弱い影響も示唆しています。 実際、IF apo および OF bMRP1-(ATP)2 MD シミュレーションは、IF bMRP1-LTX、bMRP1-(ATP)2、および bMRP1-LTX-(ATP)2 よりもわずかに規則性の低い脂質尾部プロファイルを示しました。 これは、それぞれIFおよびOFコンフォメーションの細胞内および細胞外の開口部のばらつきが大きく、それが周囲の脂質のより顕著な置換を引き起こす可能性が高いことによって説明される可能性があります。 脂質二重層構造に対する bMRP1 立体構造の影響を文書化するために、膜自由エネルギー変形 30 も評価されました (補足表 10-12 および図 4c)。 計算では、bMRP1 の存在が純粋な POPC 脂質二重層構造を不安定化させることが示唆されていますが、興味深いことに、POPC:POPE:Chol (2:1:1) では逆の傾向が観察され、bMRP1 の存在下では膜が安定化されます (ΔGdeformation < 0、図を参照) .4c）。 POPC:Chol (3:1) 脂質二重層膜では中間の挙動が観察され、bMRP1 の存在により脂質二重層構造が全体的に不安定化されましたが、その程度は純粋な POPC よりも著しく低かったです。 純粋なPOPC脂質二重層で実行されたシミュレーションを除き、計算された変形自由エネルギーは、IF apo bMRP1状態の方が他の立体構造よりも大きく、これはおそらくATPおよび/または基質の非存在下での前述のより大きな柔軟性によるものと思われます。

脂質依存の二次元密度分析と周囲の脂質の分布の評価により、重要なコレステロールとPE脂質のホットスポットが明らかになりました。 たとえば、PE脂質は、シミュレーションの50％以上で、TMH7以前のエルボヘリックスおよびL0ドメインの近くに優先的に結合することが示されました（図4d、補足図33〜36の計算された2D密度プロファイル）。 。 電子密度マップにより、3つのコレステロール分子が分解されたOF bMRP1構造に結合していることが明らかになり、そのうち2つは50％を超える確率で初期位置の近くに維持されていました（補足図33）。 興味深いことに、pre-TMH7によるものはMDシミュレーションに沿って強く（80％以上）維持され、pre-TMH7エルボヘリックスに沿って、すなわち脂質二重層に平行に配向されています（図4d）。 このプレTMH7コレステロールホットスポットは、たとえばIF apo POPC:POPE:Chol (2:1:1)シミュレーションでも観察されました(図4c)。 程度は低いですが、2番目に分解されたコレステロール分子は、TMH1前のエルボヘリックスによってタンパク質と接触したままになります（補足図33）。 興味深いことに、TMH7以前のエルボヘリックスと比較したこのほぼ擬似対称的なホットスポットは、IF bMRP1立体構造で実行されたシミュレーションでも観察されました（図4d）。 アロステリック経路分析により、図4eに示すように、基質結合ポケットからNBSへの情報伝達におけるプレTMH1および-TMH7エルボヘリックスに近いコレステロール分子の重要な役割が強調されました。 実際、これらのコレステロール分子の媒介性を計算すると、これらのコレステロール分子が基質結合部位から NBS へのアロステリック伝達に積極的に関与していることが明らかに示唆されました。 最後に、TMH5 と TMH8 の間の界面で観察された最後に分離されたコレステロール分子は、MD シミュレーションに沿ってタンパク質コアと接触したままではありません。 しかし、計算されたコレステロールの 2D 密度プロファイルは、この領域にコレステロールが存在する確率が若干高いことを示唆しており、解析された分子が MD シミュレーションに沿って交換されたことを示唆しています。 さらに、そのようなプロファイルは、TMH4による水平方向に配向されたコレステロール分子など、より高密度のスポットも明らかにしました（補足図35〜36）。

ABCC7/CFTR がクロライド チャネルであり 31、スルホニル尿素受容体 (ABCC8 および ABCC9) がカリウム チャネルの制御に関与している 32 ことを考えると、bMRP1 は、これまでのところクライオ EM によって解明された ABC 薬物輸出体 C ファミリーの唯一のメンバーです。 過去 10 年間、ITC によって指摘されている薬物動態における臨床的および薬理学的に関連する役割を考慮して、MRP1、MRP2、および MRP4 を含む MRP トランスポーターに特に注目が払われてきました 12,13。 そのいとこであるABCB1/P-gpとは対照的に、MRP1の動態と機能に関する知識は、IFアポ状態や基質結合状態8、加水分解前および加水分解後の2つのOF状態など複数の状態で解明されているにもかかわらず、依然として断片的なままである。構造は、それぞれ 2 つの ATP 分子または ADP/ATP ペアのいずれかに結合します。 本研究では、PC および PE 脂質やコレステロールを含む脂質二重層モデルのさまざまな混合物を考慮して、さまざまな状態における bMRP1 の立体構造ダイナミクスを捉えるために、広範な全原子 MD シミュレーションが実行されました。 我々は、(i) 界面活性剤で行われた実験的観察を完了し、(ii) 少なくとも他の ABC C ファミリートランスポーターに拡張される可能性のある構造パターンを強調するために、MD ベースの計算アプローチを提案します。

POPC:POPE:Chol (2:1:1) におけるグローバルな立体配座ダイナミクスは、クライオ EM 構造と比較して IF 構造の大きな変化を示しています。 IF 状態では、ATP 分子の存在に関係なく、NBD の自発的閉鎖が体系的に観察されました。これは、すべて同じ部分空間に向かって収束する IC 角度と NBD 距離の値によって示されています。 ABC立体構造空間に関しては、両方のNBSにATP分子が存在するか、TMD結合ポケットに基質が存在すると、NBDツイスト値を調節することによってNBD二量体化のダイナミクスが主にシフトします（図2bおよび補足図5）。 したがって、私たちの MD シミュレーションは、自然の膜環境では広く開いた IF 構造はありそうもないという最近の観察 6,7 と完全に一致しています。 したがって、クライオ EM 実験で観察された広く開いた構造は、構造分解のための非生理学的環境の使用によるアーチファクトによるものであると考えられています 7。これは、たとえば界面活性剤またはナノディスクのいずれかで再構成された P-gp で観察された構造の違いと一致します 11 。 NBD1 の「ボールとソケット」構造の欠如など、NBD1 の 13 アミノ酸の欠失は、NBD1 と TMH10/TMH11 の間の結合を弱める可能性があります。 基質が存在しない場合、これは NBD1 に関する翻訳の柔軟性が大きくなり、NBD 二量体の開口につながります。 しかし、ATP分子と基質の存在下では、緊密なNBDダイマー立体構造のみが観察され（図2a）、TMDと両方のNBS間のアロステリックコミュニケーションを強調しています。 TMH10/TMH11 と NBD1 の間の結合が低いため、TMD と NBD の間のアロステリーは主に NBD2 を介して媒介されると予想されます。 興味深いことに、NBS1 は ATP 分子の非存在下でも形成されました (図 2a)。 これは、ATP 分子が存在しない場合でも、IF から OF への遷移が実験的に観察された理由も説明する可能性があります 5。 しかし、ナノボディを用いたクライオ EM によってワイドオープン IF コンフォメーションを採用する NBS 縮退 ABC トランスポーターが最近解明されたことを考えると、そのような仮定は慎重に考慮される必要があります 33。 我々の結果は、単一のATP加水分解を必要とすることによって輸送機能を維持しながらエネルギーを節約することによって生じる可能性がある、ABC輸送体の進化としてのNBDとNBSの非対称性の重要性を強調している。

主に疎水性基質を輸送する P-gp とは対照的に、MRP1 は主にアニオン性両親媒性基質を運ぶと予想されます 2。 構造観察と一致して、P-gp8とは対照的に、脂質二重層にはアクセスチャネルが存在しないため、膜の高密度または低密度の脂質尾部領域から直接基質にアクセスする可能性は非常に低い。 ただし、両親媒性基板は高密度の極性ヘッド領域で分割される可能性があります。 したがって、MRP1基質へのアクセスは、細胞質から直接、または高密度極頭部領域から発生すると予想され、TMH4およびTMH6を介してアクセスが可能である可能性があります（補足図37）。 bMRP1 の反対側では、我々の MD シミュレーションは、かさばる基質では TMH10 と TMH12 間の基質アクセスの可能性が低い可能性を示唆しています。 ただし、そのような仮定にはさらなる生化学的および構造的研究が必要です。

今回の研究では、脂質二重膜とタンパク質の動態の間の相互作用も調査しました。 まず、現在のシミュレーションは各レプリカに対して数μ秒間実行されたことに注意することが重要です。 輸送プロセスの時間スケールを考慮すると、現在の結果は、さまざまな立体構造状態の平衡領域における脂質とタンパク質の相互作用を解読するためにのみ使用できます。 コレステロールフリー膜やPEフリー膜などのさまざまな脂質二重層モデルを試すことで、bMRP1のダイナミクスが調節されます。 以前の生物物理学的研究と一致して、PC ベースの膜にコレステロールが存在すると膜の剛性が増加し、その結果、MRP129 の立体構造ダイナミクスが低下しました。 局所最小構造に対する PE 脂質の影響は、IF 状態ではかなり限定されると予想されます。 しかし、興味深いことに、OF構造下でのECの開口は、PEの存在下でより有利であるように見えました（図4a）。 全体として、我々の結果は、脂質二重層の組成に関係なく、MRP1の構造が特定の状態に対して同様の構造をとる可能性が高いことも示唆しています。 ただし、これは構造遷移と反応速度に役割を果たしている可能性があります。 この仮説は、他の MRP トランスポーターについても慎重に検討する必要があります。 実際、例えばMRP2およびMRP4とは対照的に、MRP1は、脂質二重層組成が異なる可能性のある異なる細胞型で観察される遍在性のエクスポーターである。 したがって、他の MRP メンバーは脂質二重膜組成に対してより敏感になる可能性があると推測できます。

タンパク質の動態における脂質二重層の物理的役割のうち、我々の結果は、脂質成分がトランスポーター機能においても積極的な役割を果たすことを裏付けています。 他の膜タンパク質で行われた計算による観察と一致して、脂質成分は TMD から NBD へのアロステリーに関与しています。 さらに重要なことは、コレステロールがプレTMH1およびプレTMH7エルボヘリックスに結合し、これらのアロステリック経路に強く関与していることです。 このような発見は、MRP1輸送機能に必要であることが示されている投げ縄プレTMDモチーフ(L0)の役割に関する道を開く8,17。 他の膜受容体やチャネルと比較して、MRP1 における脂質の役割は限定的であるように聞こえるかもしれませんが、脂質とタンパク質の相互作用には、タンパク質の動態に対する生物物理学的影響だけでなく、最近提案されている輸送調節因子としても、より多くの注意を払う必要があります。 P-gp11。

本研究は、稀な変異/多型や疾患に基づく膜の影響など、局所薬物動態におけるMRPの役割などのさらなる研究のために、NBS変性ABCCトランスポーターの機能および脂質-タンパク質相互作用についての構造的洞察を提供した。個別化医療に向けた脂質不均衡。

bMRP1の輸送サイクルに沿ったマイルストーン構造の概要を得るために、本研究ではさまざまな立体構造と結合状態を考慮しました：IF apo bMRP1、IF bMRP1-(ATP)2、IF bMRP1-LTX、IF bMRP1-LTX- (ATP)2 および OF bMRP1-(ATP)2。 クライオ EM 構造は、IF (PDB ID: 5UJ98 および 5UJA8) および OF 立体配座 (PDB ID: 6BHU4) の開始構造として使用されました。 OF 立体構造は、ATP 加水分解速度を低下させ、OF 構造決定を促進することが示された E1454Q 変異体を使用して解析されました4。 この変異は、本研究のために手動で元に戻されました。 いわゆる TMD0 は、基板の輸送に影響を及ぼさないことがすでに示されているため、現在のモデルには含まれていません 3、4、8。 しかし、いわゆるプレTMH1ラッソドメイン（L0）はMRP1の機能に必須である一方で、どのクライオEM MRP1構造でも完全には解決されていないことが示されました8、17。 L0 ドメインの欠落部分は、IF コンフォメーションと OF コンフォメーションに対して、それぞれ I-Tasser (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) サーバー 36 またはモデラー v9.2337 のいずれかを使用してモデル化されました。 実際、I-Tasser は当初、IF モデルと比較して、OF bMRP1-(ATP)2 状態の一貫した L0 ドメインを予測できませんでした。 したがって、一貫性を保つために、OF bMRP1-(ATP)2 L0ドメインは、配列に基づいてモデラーv9.23を使用して構築されましたが、テンプレートとしてIF L0ドメインモデルも使用されました（補足表13）。 L0ドメインモデル間の一貫性を確保するために、構造とダイナミクスは、MDシミュレーション上のRMSFを評価することによって監視されましたが、同様の二次構造に向かって収束した最終的なL0ドメインモデル構造を比較することによっても監視されました（補足図38および39）。 同様に、TMH6 と NBD1 間の欠落していたループも現在のモデルに追加されました。

IF立体構造は、異なる結合状態、すなわちapo、ATP2結合状態、LTX結合状態、およびLTX-(ATP)2結合状態で構築されたが、OF立体構造はATP2結合状態のみで構築された。 IF bMRP1-(ATP)2 および IF bMRP1-LTX-(ATP)2 は、ATP 分子と Mg2+ の両方が NBS に結合している OF 構造の NBD に、それぞれ 5UJ9 および 5UJA の NBD を別々に重ね合わせることで構築されました。 すべての最終モデルは、非物理的な立体衝突を避けるために、Amber18 パッケージ 38,39 を使用して真空中ですぐに最小化されました。

CHARMM-GUI 入力ジェネレーター 40,41 を使用して、bMRP1 座標を利用して、さまざまな bMRP1 モデルをさまざまな脂質二重層、すなわち純粋な POPC、POPC:Chol (3:1) および POPC:POPE:Chol (2:1:1) に埋め込みました。 OPM (膜内タンパク質の方向) データベースから取得42。 PE脂質との脂質-タンパク質相互作用を特異的に調べるために、IF apo bMRP1およびOF bMRP1-(ATP)2構造も純粋なPOPEおよびPOPC:POPE(3:1)脂質二重層に埋め込まれました。 OF bMRP1-(ATP)2 の分解されたクライオ EM 構造には、3 つの分解されたコレステロール分子も含まれています。これらは、それらの重要性を調査するためにすべてのシミュレーション中に保持されました。 これらの異なる脂質二重層組成から、POPC:POPE:Chol (2:1:1) 混合物がモデル細胞膜に最も適切であると考えられました。 他の種類の膜は、タンパク質の動態における各脂質の役割を理解するのに役立つと考えられました。 すべてのシステムの元の合計サイズは約 10 インチでした。 120 × 120 × 180 Å3 (システムの説明については補足表 14 を参照)。 生理学的条件を模倣するために、0.15 M NaCl を使用し、TIP3P 明示的な水分子を使用して系を溶媒和しました 43、44、45。 最終的なシステムは約 100% の材料で作られています。 245,000 個の原子 (詳細は補足表 14 を参照)。

CHARMM-GUI40、41 の出力は、AmberTools スクリプト 38、39 (つまり、charmmlipid2amber.py および pdb4amber) を使用して Amber 形式に変換されました。 ATP2 および LTX 結合システムに関しては、タンパク質 - 脂質システムを構築した後、基質、ヌクレオチド、および Mg2+ イオンが追加されました。 したがって、対応する数の対イオンをランダムに除去することで中性が確保されました。 Amber FF14SB46、Lipid1747、および改変された DNA.OL1548,49 力場を使用して、それぞれタンパク質残基、脂質、ATP 分子をモデル化しました。 水の分子、Mg2+ イオン、および対イオンは、TIP3P 水モデル 43,44,45 と、Joung および Cheatham からの対応する一価および二価のイオンパラメーター 50,51 を使用してモデル化されました。 LTX (ロイコトリエン C4) 基質パラメーターは、Antechamber ソフトウェア 53 を使用して、Generalized Amber Force Field バージョン 2 (GAFF2) 52 から導出されました。 LTX の部分原子電荷は、RED サーバーを使用した HF/6-31G* 理論レベルでの量子力学に基づく計算から導出されています54。 各システムは周期境界条件を使用してシミュレートされました。 非結合相互作用のカットオフは、クーロン ポテンシャルとファン デル ワールス ポテンシャルの両方で 10 Å でした。 長距離静電相互作用は、粒子メッシュ Ewald 法 55 を使用して計算されました。

システムの最小化と熱化、および MD シミュレーションは、CPU および GPU の PMEMD バージョンを使用して、Amber18 および Amber20 パッケージ 38,39 で実行されました。 最小化は、次の順序で最小化する 4 つのステップで実行されました。(i) 水 O 原子 (20,000 ステップ)。 (ii) H 原子を含むすべての結合 (20,000 ステップ)。 (iii)水分子と対イオン (50,000 ステップ)、および (iv) システム全体 (50,000 ステップ)。 次に、各システムは 2 つのステップで熱化されました。(i) 0.5 fs の時間積分を使用して、(N、V、T) アンサンブル条件下で 50 ps の間に水分子が 100 K まで熱化されました。 (ii) 次に、半等方性条件で 2 fs タイムステップの (N,P,T) アンサンブル条件下で 500 ps の間、システム全体を 100 K から 310 K まで熱化しました。 次に、各システムは、Berendsen 気圧計を使用して、半等方性条件で 2 fs タイムステップの (N、P、T) アンサンブル条件下で 5 ns の間平衡化されました。 次に、準等方性スケーリングを使用した (N、P、T) アンサンブル条件下で、2 fs の積分タイムステップでマイクロ秒スケールで生産実行を実行しました。 温度は、衝突頻度 1.0 ps-1 のランジュバン動力学サーモスタット 56 を使用して維持されました。 1 bar に設定された一定圧力は、IF apo bMRP1 および OF bMRP1-(ATP)2 の場合は Berendsen barostat57 を使用するか、IF bMRP1-(ATP)2、IF bMRP1-LTX および IF bMRP1 の場合はモンテカルロ バロスタットを使用する半等方性圧力スケーリングで維持されました。 -LTX-(ATP)2. 後者は計算時間を短縮するために使用されました。

NBS への ATP のドッキングを確実にするために、Wen et al.58 によって提案されたのと同様のアプローチを使用して拘束 MD シミュレーションが実行されました。 すぐに、A ループのトリプトファン/チロシン残基 (NBD1 と NBD2 のそれぞれ Trp653 と Tyr1301) と対応する ATP プリン部分の間に、一連の距離に基づく制限が適用されました。 Mg2+-ATP-NBDの配置は、Mg2+イオンとATPリン酸基の間、およびMg2+イオンとWalker AセリンおよびQループグルタミン残基（すなわち、NBD1ではSer685およびGln713、NBD2ではSer1333、Gln1374）の間に拘束を適用することによって維持された。 さらに、ATP リン酸部分も周囲の Walker A 残基によって抑制されました。 すべての距離は、最小距離と力定数が補足表 15 ～ 16 に報告されている調和ポテンシャルを使用して制限されました。 熱化およびボックス平衡化ステップには、距離に基づく制約が適用されました。 その後、生産実行の最初の 10 ns でスムーズに除去されました。 Mg2+ イオンに対する制限は、シミュレーション全体を通じて維持されました。

スナップショットは 100 ps ごとに保存されました。 各システムについて、局所構造空間をより適切にサンプリングするために 3 つのレプリカが実行されました。 各生産実行は、IF モデルと OF モデルの場合、それぞれ 2.0 ～ 2.5 μs と 1.5 ～ 2.0 μs で実行されました (補足表 17)。 実際、OF モデルを使用して実行されたシミュレーションは、IF 配座よりも早く平衡に達しました (補足図 40 の時間依存 RMSD を参照)。 本研究では、合計の MD 時間は 112.4 μs です。

シミュレーションは、CPPTRAJ59 パッケージと、MDAnalysis モジュール 60、61 を利用した社内の Python スクリプトを使用して分析されました。 プロットは、matplotlib v3.3.1 Python パッケージ 62 を使用して取得されました。 構造の視覚化とレンダリングは、VMD ソフトウェア63 (v1.9.3 およびアルファ版 v1.9.4) を使用して準備されました。 いわゆる ABC 構造パラメーター (つまり、IC 角度、EC 角度、NDB 距離、NBD ねじれ、および EC 距離) は、Hofmann et al.1 が IC 角度、EC 角度、EC 距離、および NBD に対して提案したものと同じ定義を使用して計算されました。 NBD ツイストについては距離または Moradi et al.18。 簡単に説明すると、IC 角度は基板入口の IC 開口部を表し、2 つのベクトル間の角度によって定義されます。 どちらも細胞外領域全体の質量中心から始まり、TMH1、TMH2、TMH3、TMH6、TMH10、およびTMH11のIC領域、またはTMH4、TMH5、TMH7、TMH8、TMH9、およびTMH12のIC領域のいずれかに向けられています。 同様に、EC 角度は基質放出のための EC 開口部を表し、両方の NBD の質量中心から始まり、TMH1、TMH2、TMH9、TMH10、TMH11、および TMH11 のいずれかの EC 領域に向かう 2 つのベクトル間の角度によって定義されます。 TMH12、または TMH3、TMH4、TMH5、TMH6、TMH7、および TMH8 の EC 領域。 EC 距離は、TMH1、TMH2、TMH9、TMH10、TMH11、および TMH12 の EC 領域と、TMH3、TMH4、TMH5、TMH6、TMH7、および TMH8 の EC 領域間の距離として定義されました。 NBD 距離は、2 つの NBD 重心間の距離として定義されました。 これらの定義は、bMRP1 の現在の MD モデルだけでなく、他の ABC トランスポーターの利用可能な解決された構造にも適用されたため、細胞内および細胞外領域は、OPM データベースで提案されている膜厚に基づいて定義されました 42。 各システムおよび各構造パラメーターの残基選択を補足表 1 に報告します。各システムおよび各脂質二重層について、ガウス混合モデル (GMM) を利用する InfleCS アプローチを使用して局所自由エネルギーランドスケープを計算しました 23,64。 構造パラメーター (つまり、IC 角度と EC 角度、NBD 距離とねじれ) は、80 に設定されたグリッド サイズを使用して、最大 20 回の反復で得られた各 GMM の 2 ～ 12 ガウス成分から自由エネルギー ランドスケープを監視するために取得されました。 InfleCS アプローチの妥当性は、MD シミュレーション中のサンプリングの品質に大きく依存します。 現在の研究では、InfleCS は MD シミュレーション中にサンプリングされた極小値付近の自由エネルギーの状況のみを描画します。 さらに、現在のシステムに対するMDサンプリングとInfleCSの関連性は、各構造パラメータの収束プロファイルを個別に計算することによって保証されました（補足図41〜43）。

bMRP1 TM キャビティの水細孔プロファイルは、Hole2.2 ソフトウェア 65 を使用して 10 ns ごとにスナップショットを取得して計算されました。 平均 TM 細孔プロファイルは、すべてのレプリカを考慮して軌跡の平衡部分を平均することによって計算されました。 初めからの時間依存的な TM 細孔の進化も、MD 軌道に沿って 100 ns ごとにブートストラップすることにより、脂質二重層膜の選択された深さ (z = 18、5、-15、および -22 Å) で計算されました (つまり、10 スナップショット × 3 レプリカ、各 100 ns）。 次にプロファイルを平均し、PC P 原子の Z 密度プロファイルを使用して脂質二重層膜の中心 (z = 0) を定義しました。 傾斜角に関しては、すべてのシステムが POPC:POPE:Chol (2:1:1) に埋め込まれた OF bMRP-(ATP)2 モデルに合わせて調整されました。 脂質分布は、CPPTRAJ59 パッケージを使用して取得されました。 脂質占有率は、50 または 80% の閾値占有率を考慮して、各極頭部 (つまり、PE または PC) またはタンパク質周囲のコレステロール分子全体について計算されました。 小葉依存性脂質密度は、極頭部脂質 (PE または PC) またはコレステロール OH グループに焦点を当てた CPPTRAJ のグリッド キーワードを使用して計算されました。 PC および PE 脂質のリン酸原子またはコレステロール分子の O 原子の z 依存密度ピークをモニタリングすることによって得られた高密度極頭部領域のみに焦点を当てました。 膜の厚さは、VMD63、66 の MEMBPLUGIN を使用して取得しました。 自由エネルギー変形は、CTMDapp ソフトウェア 30 を使用して、bMRP1 の存在下での膜変形の自由エネルギーコストと平膜の自由エネルギー基準を計算することによって評価しました。 これらの計算に使用されたすべてのパラメーターは補足表18に報告されています。現在のサンプリング、タンパク質のサイズ、および現在の全原子シミュレーションにおける曲げ弾性率と圧縮率の関連性を考慮して、図4cに示された結果が定性的に議論されています。

TMH1 から TMH12、NBD1、および NBD2 の骨格原子によって定義される ABC コアに焦点を当てて、CPPTRAJ59 パッケージを使用して主成分分析も実行されました。 システムの変動性は、各レプリカをシステムの平均的な構造に合わせて調整した各システムに対して独立した PCA を実行することによって調査されました。 ネットワーク分析は、VMD ネットワーク分析プラグイン 63,67 を使用して実行されました。 動的相互相関行列 (DCCM) は、Cα 原子がノードとして選択され、すべてのデフォルト制限 (notSameResidue、notNeighboringCALpha、notNeighboringPhosphate、notNeighboringResidue) が適用されたレプリカごとに個別に計算されました。 次に、コミュニティは gncommunities67 を使用して計算されました。 アロステリーネットワーク経路は、Westerlund らによって開発された最近の Allopath アプローチを使用して決定されました 26,27。 すぐに、2つのドメイン間の遠い「通信効率」が、接触マップとタンパク質残基の相互情報マトリックス、および周囲の脂質や結合分子（ヌクレオチドや基質など）などの非タンパク質相互作用物質から得られました。 このようなアプローチは、各成分（すなわち、残基、脂質、基質、およびヌクレオチド）の関与を描写する媒介性プロファイルも提供する。 各脂質分子について、極性頭部グループと 2 つの脂質尾部に対応する 3 つのノードが定義されました (補足図 44)。 ATP はまた、プリンとリボース部分、および三リン酸尾部の 3 つのノードに分割されました。 LTX 基質は、グルタチオン部分、多価不飽和尾部、ヒドロキシペンタン酸の 3 つのノードに分割されました。 Mg2+ イオンとコレステロール分子はそれぞれ 1 つのノードと見なされます。 ノードごとの原子選択は補足図44に報告されています。アロステリック経路は、補足表9に定義されているように、基質結合ポケットから各NBSまで個別に計算されました。 H結合分析（補足図45および46）はCPPTRAJ59を使用して実行されました。ここで、距離と角度のカットオフはそれぞれ 3.5 Å と 120° に設定されました。 CPPTRAJを使用して計算されたDCCMも補足図で利用できます。 47～50。 極小値の構造記述は、MD シミュレーションの平衡部分でのみ実行されました。つまり、補足図 41 で報告された RMSD プロファイルから示されているように、最後の 800 ns を考慮しています。

この論文で説明されているすべての MD 解析では、データは各状態 (つまり、IF apo bMRP1、bMRP1-LTX、bMRP1-(ATP)2、bMRP1-LTX-(ATP)2、および OF bMRP1) の n = 3 MD シミュレーションから得られました。 -(ATP)2) および脂質二重層膜 (すべての状態の純粋な POPC、POPC:Chol (3:1)、および POPC:POPE:Chol (2:1:1) だけでなく、純粋な POPE および POPC:POPE ( 3:1) IF apo bMRP1 および OF bMRP1-(ATP)2)。 言い換えれば、57 回のシミュレーションに対して 19 個のシステムが検討されました。 分析は、各システムが独立していることを考慮して体系的に実行されました。 平均値と標準偏差は、通常、各レプリカからデータをまとめて抽出して、サンプリングされた構造のばらつきを表示することによって取得されました。 水素結合解析、自由エネルギー変形、アロステリックコミュニケーションの場合、結果は各レプリカに対して個別に計算され、独立して処理された 3 つのレプリカの平均、標準偏差、誤差が得られました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で実行された MD シミュレーションから生成されたデータセットは、合理的な要求に応じて著者から入手できます。 主要な図に示されている結果とプロットの基礎となるソース データ、MD 入力、各状態と脂質モデルの初期および最終の座標構成、および補足ムービー 1 ～ 5 は、次の Zenodo アクセス リンクでダウンロードできます: https://doi .org/10.5281/zenodo.7541178。

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著者らは、刺激的で実りある科学的議論をしてくださったベンジャミン・シャンテマルグ博士とメディ・ベンマメリ博士に感謝します。 スーパーコンピューター設備に関する技術支援をしていただいたリモージュ大学 IT 部門の Xavier Montagutelli 氏に感謝いたします。 計算は、リモージュ大学がホストする CALI (「CALcul en LImousin」) および「Baba Yaga」スーパーコンピューター、および IDRIS HPC リソースの国立スーパーコンピューター「Jean-Zay」を使用して、割り当て 2020-A0080711487 および 2021-A0100711487 に基づいて実行されました。 GENCI製。 この研究は、「国立研究庁」(ANR-19-CE17-0020-01 IMOTEP および ANR-21-CE18-0030 RAPRACLID)、ヌーベル アキテーヌ地域圏および「国立サンテ・デ・ラ研究所」からの助成金によって支援されました。 Recherche Médicale」 (INSERM、AAP-NA-2019-VICTOR)。

Inserm U1248 薬理学および移植、ΩHealth Institute—Univ. Limoges, 2 rue du Prof. Descottes, 87000 F, リモージュ, フランス

アゴタ・トート、アンジェリカ・ヤナスキェヴィチ、ヴェロニカ・クレスピ、フロラン・ディ・メオ

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で。 そしてFDMがこの研究を発案した。 で。 FDM がすべてのシミュレーションを実施しました。 Á.T.、AJ、VC、FDM がシミュレーションを分析しました。 で。 FDM は結果を解釈し、AJ および VC Á.T と一緒に議論しました。 FDM が原稿を書き、すべての著者によって編集、レビュー、承認されました。

フロラン・ディ・メオへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に対する Mahmoud Moradi 氏と Shuguang Yuan 氏の貢献に感謝します。 主な編集者: Yun Lyna Luo と Gene Chong。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

トート、Á.、ヤナシュキェヴィチ、A.、クレスピ、V. 他脂質と NBS 縮退 ABC トランスポーターの非対称動態の間の相互作用について。 Commun Biol 6、149 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04537-3

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受信日: 2022 年 5 月 20 日

受理日: 2023 年 1 月 25 日

公開日: 2023 年 2 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04537-3

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