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Jan 02, 2024

SARS

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 5、記事番号: 1170 (2022) この記事を引用

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6 引用

26 オルトメトリック

メトリクスの詳細

SARS-CoV-2 ウイルスエンベロープから突き出ている三量体スパイク（S）糖タンパク質は、少なくとも 1 つのプロトマーの受容体結合ドメイン（RBD）が「ダウン」（閉じた）から「アップ」に切り替わることによって開始され、ヒト ACE2 に結合します。 」（開いた）状態。 ここでは、大規模な分子動力学シミュレーションと、1,000 を超えるウィンドウと合計 160 μs のシミュレーションを使用した 2 次元レプリカ交換アンブレラ サンプリング計算を使用して、グリカンの有無にかかわらずこの遷移を調査しました。 我々は、グリコシル化されたスパイクは開口に対する障壁が高く、エネルギー的にもアップ状態よりもダウン状態に有利​​であることを発見しました。 S タンパク質の開口経路の分析により、N165 と N122 のグリカンがアップ状態の RBD と N 末端ドメイン間の水素結合を妨げる一方、N165 と N343 のグリカンはダウン状態とアップ状態の両方を安定化できることが明らかになりました。 最後に、いくつかの既知の抗体のエピトープ露出が開口経路に沿ってどのように変化するかを推定します。 BD-368-2 抗体のエピトープが継続的に露出していることがわかり、その高い有効性が説明されています。

SARS-CoV-2 コロナウイルスによって引き起こされた COVID-19 のパンデミックは急速に世界中に広がり、世界の健康と経済に前例のない悪影響を及ぼしました1。 いくつかのワクチン 2、モノクローナル抗体治療法 3、および治療薬 4 の急速な開発により、現在のウイルスの流行は緩和されています。 しかし、現在優勢なオミクロン亜系統5を含む変異体の継続的な脅威と、将来のコロナウイルス発生の可能性6により、認識、結合、感染、免疫応答を含むウイルスのライフサイクルを徹底的に理解することが必要です。

SARS-CoV-2 感染は、宿主細胞のアンジオテンシン変換酵素 2 (ACE2) 受容体を認識して結合することによって開始されます 7,8。 このプロセスは、SARS-CoV-2 ビリオンの表面から突き出ているホモ三量体クラス I 融合糖タンパク質である SARS-CoV-2 スパイク (S) タンパク質によって媒介されます。 2020 年初頭に S タンパク質配列が公開されたことと、関連するベータコロナウイルスに関する初期の構造研究と組み合わせることで、可溶化され融合前に安定化された S タンパク質外部ドメイン構築物 9、10、11 および全長スパイク 12 の構造が迅速に決定されました。無傷のビリオン13. 各プロトマーは、多塩基性フューリン切断部位によって分離された S1 サブユニットと S2 サブユニットで構成されます。 S1 は受容体結合ドメイン (RBD) を含み、宿主細胞の認識を媒介する一方、S2 はウイルスの侵入に必要な膜融合機構から構成されます 7。 S タンパク質は、RBD や N 末端ドメイン (NTD) など、ヒトの免疫系の標的となる複数のエピトープを持つ主要な抗原標的です 14、15、16、17。 組換え RBD は、SARS-CoV-218 に対する潜在的な侵入阻害剤であることも示唆されています。 さらに、S タンパク質のグリコシル化は、ウイルスをマスキングして宿主の免疫系応答から防御するのに役立ちます 19、20、21。 S タンパク質は、ダウンおよびアップ構造状態によって特徴付けられ、ヒンジのような動きを介して一時的に相互変換され、RBD 残基 S438 から Q50622 で構成される受容体結合モチーフ (RBM) が露出します。 RBM はダウン S タンパク質のプロトマー間界面に埋め込まれています。 したがって、ACE2 への結合は、ダウン状態とアップ状態の間の確率的相互変換に依存します。

クライオ電子顕微鏡（クライオ EM）研究により、アップ構造状態とダウン構造状態の両方に関する詳細な構造情報が明らかになりました 23。 しかし、これらのアップ/ダウン状態のダイナミクスとそれらの間の相互変換を調査した研究は比較的少数です。 たとえば、単一分子 FRET は、S タンパク質遷移の確率的性質を実証するために使用されており 24、ミリ秒から数秒のオーダーの時間スケールが報告されています。 注目すべきことに、その後の単一分子FRET研究では、変異体スパイクタンパク質の下方から上方への遷移速度の変化が発見されている25。 分子動力学 (MD) シミュレーションは、S タンパク質の開口ダイナミクスを特徴付けるために必要なダウンとアップの間の中間状態の原子レベルの説明を提供することで、これらの実験研究を補完します。 MD シミュレーションにより、ダウン状態とアップ状態の両方の構造安定性とグリコシル化の役割、さらに残基間相互作用と ACE220、21、26、27、28、29 への結合の詳細に関する詳細な情報が明らかになりました。 誘導 MD および標的化 MD を使用して決定された開口経路が報告されています 29、30、31。 さらに、重み付けアンサンブル 32 や、Folding@home 33 と組み合わせた特定形質の変動増幅 (FAST) 適応サンプリングなどの強化されたサンプリング技術を使用した広範なシミュレーションにより、S タンパク質開口部の複数の経路の詳細が得られました。 さらに、ウイルスの結合と侵入に必要なこれらの構造遷移のエネルギー状況の特徴が明らかになり始めています 27,30,31,34。これには、低温 EM データと MD シミュレーションを組み合わせて、両方のウイルスの複数の部分集団を明らかにすることが含まれます。ダウン状態とアップ状態35、36。

Amaro らによる最近の研究では、S タンパク質のダウン状態とアップ状態の個別の平衡シミュレーションに基づいて、シールドを超えた N165 と N234 のグリカンの機能的役割が強調されています 26。 RBD がアップ状態に移行すると、N234 のグリカンが回転して空隙が形成され、アップ構造が安定します。 さらに、MD シミュレーションと突然変異誘発により、N343 のグリカンが RBD の開口と ACE2 結合の動態に寄与していることが明らかになりました 32。 これらの結果は、「グリカンゲーティング」と呼ばれる、複数のRBD残基との逐次相互作用によるRBDの「リフト」による開始構造転移におけるN343のグリカンの役割を示唆した。

ここでは、オークリッジにあるプレエクサスケールのスーパーコンピューターSummitで実行されるレプリカ交換アンブレラサンプリング（REUS）シミュレーションを使用して、SARS-CoV-2 Sタンパク質の開閉遷移の新たに決定された二次元（2D）自由エネルギーランドスケープについて説明します。グリコシル化および非グリコシル化 S タンパク質の National Lab (ORNL)。 各状態およびスパイクの開口の反応速度に対する糖鎖の影響を強調します。 さらに、S タンパク質表面の顕著なエピトープの露出を分析し、スパイク開口経路に沿った抗体結合の動的な画像を提供しました。 最後に、グリカンの安定化の役割をさらに特徴付けるために、ダウンおよびアップ構造状態のグリコシル化および非グリコシル化システムの平衡 MD シミュレーションの結果を報告します。

REUS シミュレーションを使用して、完全にグリコシル化された場合と非グリコシル化された場合のスパイクのダウン状態からアップ状態への自由エネルギーの変化を研究しました。 我々は、Walls et al.10 (PDB: 6VYB) のジプロリン変異体構造に基づいて野生型 (WT) アップ状態をモデル化しました。 ダウン状態は、ジプロリン変異のない、Cai et al.12 (PDB: 6XR8) のより新しい構造を使用してモデル化されました。 Chrispin らの各施設の質量分析データ 19 で最も多く存在するグリカンは、Woods グループが開発した GLYCAM Web サーバー (http://glycam.org) 37,38 を使用して追加されました。 これらのモデルは図 1a、b に示されており、システムの詳細は「方法」で提供されています。

a プロトマーによって着色された、オールダウン状態の三量体 S タンパク質。 グリカンは赤い球として表示されます。 b ワンアップ状態の S プロテインの上面図。 N 末端ドメイン (NTD、14 ～ 306)、受容体結合ドメイン (RBD、336 ～ 518)、ヘプタド リピート 1 (HR1、908 ～ 986)、中央ヘリックスなど、スパイクの重要なドメインが強調表示されています。 (CH、987–1035)。 c、d RBD-A の開口部を記述するために定義された 2 つの集合変数には、次のものが含まれます。 c RBD-A (336 ～ 518、ピンク) と SD1-B (531 ～ 592、ライム) の間の重心距離 d、 d ドメイン RBD-A (336 ～ 518、ピンク)、SD1-A (531 ～ 592、紫)、SD2-A (593 ～ 677、アイスブルー) の重心によって形成される二面角 ϕ NTD-A (27–307、シアン)。 ダウン状態 (ピンク色の実線) とアップ状態 (透明なピンク色) の両方の RBD-A が示されています。

まず、ダウン状態とアップ状態のクライオ EM 構造のメタダイナミクス シミュレーションを実行し、周囲の構造空間を探索して 2 つの構造を接続できるようにしました。 構造空間は 2 つの集合変数によって記述されます。これらは、(1) 開口部 RBD-A と、ピボット ポイントとして機能するスパイクの静止部分、つまり、隣接するサブドメイン 2 の間の質量中心距離 (d) です。鎖 B (SD2-B)、および (2) 開口部 RBD-A と同じプロトマー上の他の固定ドメイン、すなわち SD2-A、SD1-A、および NTD- の質量中心によって形成される二面角 (ϕ) A (図 1c、d)。 静止ドメインは、RBD-A の可動範囲と比較して最小限のダイナミクスを持つことが検証されました (表 S1)。 次に、メタダイナミクス シミュレーションからスナップショットを抽出して、同じ 2 つの集合変数に沿って実行された REUS シミュレーションのシードを作成しました。 グリコシル化システムについては、各ウィンドウでの立体構造をランダム化するために、グリカンに対してシミュレートされたアニーリングをさらに実行しました。 最大 1049 および 1211 のウィンドウ (表 S2) を使用して、一連の REUS シミュレーションを実行して、d-φ 空間のさまざまな領域をさらに探索しました (表 S2)。グリコシル化システムと非グリコシル化システムの合計シミュレーション時間は 65 μs と 91 μs でした。 、 それぞれ。

グリコシル化システムの場合、2 つのクライオ EM 構造からの立体配座は、予想どおり平均力 (PMF) の 2D ポテンシャル上のエネルギー最小値として現れました (図 2a)。 2 つの安定な立体構造の間では、アップ状態はダウン状態よりも 5.2 ± 0.1 kcal/mol 高いエネルギーを持っています (図 2c、S1a)。 この発見は、さまざまな強化されたサンプリング方法を使用した複数の計算研究と一致しており、ダウン状態がより可能性の高い立体構造であると結論付けられています 33,34,39,40。 2 つの最終状態のエネルギー井戸の違いは、深さだけではなく、幅の広さにもあります。 エネルギー最小値より 2.5 kcal/mol 上の d に沿ったエネルギー井戸の幅を測定すると、ダウン状態のエネルギー井戸は d = 43.1 Å ～ 48.9 Å の範囲に及びますが、アップ状態のエネルギー井戸は d = 60.1 Å ～ 48.9 Å に及びます。 75.6 Å、後者の幅は前者の幅の 2.7 倍になります。 Zimmerman et al.33 および Sztain et al.32 による最近の研究でも、RBD はアップ状態で非常に柔軟であり、クライオ EM 構造よりも広く開く幅広いアップ状態構造が可能であることがわかりました。 私たちの PMF では、このような広く開いた構造を観察できる可能性を推定できるようになりました。 また、ダウン状態とアップ状態を接続する最小エネルギーパス（MEP）41、42も計算しました（図2a、補足ムービー1）。 経路は、ダウン状態のエネルギー井戸から出るときの ϕ の急激な増加と、アップ状態のエネルギー井戸に入るときの ϕ のわずかな減少を除いて、2D PMF 上ではほとんど対角線です。 2 つの安定な立体配座を隔てるエネルギー障壁の高さは 11.0 ± 0.1 kcal/mol で、d = 55.6 Å に位置します。

a、b RBD-Aの開口部を記述するために定義された2つの集合変数dおよびϕに沿ったaグリコシル化システムおよびb非グリコシル化システムの2D PMF（図1c、d）。 ダウン状態 (6XR8) およびアップ状態 (6VYB) のクライオ EM 構造の位置は、それぞれ「+」および「x」記号で示されています。 黒い点線は、各システムの MEP を示します。 c 自由エネルギーは d に投影され、1D PMF としてプロットされます。 補足データ 1 も参照してください。

非グリコシル化システムの PMF は、グリコシル化システムとは定性的には似ていますが、量的には大きく異なります (図 2b)。 グリカンがないと、ダウン状態とアップ状態の間のエネルギー差は驚くほど小さくなり、統計誤差を下回ります (図 2c、S1b)。 ダウン状態とアップ状態のエネルギー井戸間の d に沿った幅の比は、グリコシル化システムと同じ 2.7 のままで、ダウン状態の井戸は d = 43.6 Å ～ 49.1 Å の範囲にあり、アップ状態の井戸は d = からです。 59.0Å～74.1Å。 アップステートのはるかに広いエネルギー井戸により、両者のエネルギー差は小さいにもかかわらず、ダウンステートの人口 12% に対して 88% という支配的な平衡人口が生じます。 アップ状態のエネルギー最小値の位置とエネルギー障壁の両方がダウン状態に向かってシフトし、それぞれ d = 70.6 Å から 67.6 Å に、d = 55.6 Å から 52.6 Å に移動します。 また、2 つの安定な配座間のエネルギー障壁の高さが 5.1 ± 0.1 kcal/mol に減少していることにも注目します。 上記の情報を組み合わせると、我々の結果は、グリカンの除去がダウン状態とアップ状態の人口比を反転させるだけでなく、アップ状態の最小値での RBD 開口の程度にも影響を及ぼし、どちらも S の機能を破壊する可能性があることを示しています。タンパク質。 実験では、RBD 周囲のグリカン (N234、N165、および N343) 26,32 を除去するか、グリカンの複雑性を低下させる 43 と ACE2 結合の減少につながることも示されています。

S タンパク質の開口速度を定量化するために、グリコシル化システムの Smoluchowski 拡散方程式を使用して、MEP に沿った平均初回通過時間 (MFPT) を計算しました (補足注 1 を参照) 44,45。 スモルコウスキー拡散方程式は、拡散係数と MEP に沿った自由エネルギーのみに依存して、ブラウン「粒子」の簡単な説明を提供します。 追加の制約付きシミュレーションを実行して、速度自己相関関数 (VACF) を使用して MEP に沿った拡散係数を決定しました 46,47。 ダウン状態からアップ状態への MFPT は 1478.5 ミリ秒、逆は 0.9 ミリ秒です。 単一分子 FRET24 による実験的観察と比較すると、下向きから上向きの MFPT は約 5 倍過大評価され、逆方向の MFPT は約 100 倍過小評価されているようです。これは、おそらく考慮されていないという事実によるものです。拡散係数を計算する際に、グリカンが平衡化するまでの長いタイムスケールに対応します。 また、非グリコシル化システムの MFPT も近似しました。 PMFの遷移障壁の減少（図2c）により、MFPTも同時に減少し、下から上への遷移では143μs、上から下への遷移では497μsとなりました。

次に、以下のペアの反応に従って化学動力学を検討しました。

ここで、DはSタンパク質のダウン状態、Uはアップ状態、U:ACE2は結合状態を表します（図3a）。 開/閉速度 (kopen/kclose) は MFPT によって決定され、ACE2 に対する RBD 単独の結合/解離速度 (kon/koff) は Lan et al.22 から取得されます。 これらの反応のマスター方程式 ([ACE2]i = 15 nM、補足注 1 を参照) を解いた後、非グリコシル化 S タンパク質の場合、集団の 70% が結合し、23% が結合していないことがわかります。わずか 7% 減少しました (図 3b)。 RBD の詳細な変異スキャンにより、この位置に結合しているグリカンを除去する N343 への変異が結合に有害であることが判明し、ΔΔG は +0.35 ～ 2.03 kcal/mol と推定されます 48。 グリコシル化されていない S タンパク質のおおよその開閉率を使用し、変異データに従って結合/非結合率を変更すると、結合状態の集団が 8% (ΔΔG = 2.03 kcal/mol; 図 1) の間に減少することがわかります。 3d）および57％（ΔΔG = 0.35 kcal/mol、図3c）。 したがって、すべてのグリカンを除去するとアップ状態の好感度は高まりますが、それに伴う結合親和性の低下により、ACE2結合集団の予期される増加が失われる可能性があります（図3e）。

a RBD のダウン状態、アップ状態、およびバウンド状態間の遷移が、関連するレートとともに表示されます。 b – d さまざまな条件下での各状態（上向き、下向き、ACE2結合）のSタンパク質の割合、つまりbはグリカンなし、cはグリカンなし、RBDのACE2への結合の自由エネルギーの増加を0.35と仮定した場合kcal/mol、d グリカンが含まれていない場合、結合自由エネルギーは 2.03 kcal/mol 増加します。 e (b – d) の 3 つの条件の平衡における結合状態の割合。

スパイク開口のエネルギー論に対するグリカンの影響をよりよく特徴付けるために、REUS シミュレーションでグリカンが存在する場合または存在しない場合に、RBD がタンパク質の残りの部分とどのように相互作用するかを調べました。 我々は、開口部のRBD-Aとタンパク質の残りの部分の間の水素結合の数を計算し、それを経路パラメータに沿ってプロットしました（図4a、b、S2）。 一般に、RBD-A が開くとこの数は減少し、エネルギー障壁を越えた後の相互作用は明らかに増加しますが、糖鎖がない場合よりも糖鎖がある場合の方が顕著であることがわかりました。 RBD-A と形成される水素結合の総数は、特にダウン状態では、グリコシル化システムの方が多くなります。 しかし、タンパク質間の水素結合のみを考慮すると、グリコシル化されていない RBD-A は他のタンパク質ドメインとより多くの結合を形成することができます。 相互作用の全体的な減少傾向は、RBD-A が開くときにタンパク質の残りの部分から遠ざかり、その結果、隣接する RBD や S2 ドメインを含む三量体 S タンパク質の残りの部分との接触が切れるという事実によって説明されます。 ただし、この動きだけでは、エネルギー障壁を越えた後の相互作用の増加や、グリコシル化シミュレーションと非グリコシル化シミュレーションのその他の違いを説明するには不十分です。

a、b 経路パラメータ λ で示される MEP に沿って（図 S2 を参照）、開口部 RBD-A とスパイクの残りの部分の間に形成された水素結合の数がカウントされ、グリコシル化されたものとスパイクの残りの部分のドメインによって分類されます。 b グリコシル化されていないシステム。 ダウン状態およびアップ状態のエネルギー井戸の位置は白い背景で示され、他の領域は灰色の陰影で示されます。 c、d c N122 および d N165 のグリカンと、NTD-B (165 ～ 172) および RBD-A (353 ～ 360) の隣接する β ストランドとの間に形成されるグリコシル化システムの接触の平均数。グリカンによって分離されていない場合、相互に水素結合を形成します。 e REUS シミュレーションのスナップショット。N165 および N122 のグリカンが RBD-A と NTD-B 間の水素結合形成を妨害し、非グリコシル化システムと比較してアップ状態を不安定化していることを示しています。

MEPに沿った水素結合組成の変化をさらに深く掘り下げると、下から上への状態遷移におけるグリカンの役割がさらに明らかになります。 RBD-A はダウン状態にあるとき、他の 2 つの RBD および S2 ユニットの HR1/CH ヘリックスと水素結合の大部分を形成しますが、隣接する NTD-B および RBD-C とのみ相互作用するように劇的に変化します。アップ状態 (図 4a、b、S3)。 この移行中、安定化する水素結合が不足し、PMF に見られるようなエネルギー障壁の原因となります。 グリカンが含まれると、グリカンは追加の相互作用を形成してタンパク質を安定化しますが、前述のタンパク質間相互作用とも競合します。 コンパクトなダウン状態構造では、既存のタンパク質間水素結合がグリカンへの曝露から保護され、グリカンがタンパク質表面上で新たな相互作用を形成できるようになり、その結果、RBD-A と形成される水素結合の数が全体的に増加します。非グリコシル化システムと比較した場合。 ただし、このような保護はアップ状態では発生しません。 RBD-A が起動して露出すると、NTD-B との相互作用は制限されます。 具体的には、RBD-AとNTD-Bの間の水素結合のほとんどは、RBD-Aが間に挿入できるほど十分に高く持ち上げられると、N165およびN122のグリカンとの相互作用によって置き換えられます（図4c〜e）。 結果として、グリカンは間接的にダウン状態を支持し、グリコシル化システムのアップ状態の自由エネルギーの増加に寄与します。

水素結合解析を MEP を超えて 2D 集合変数空間全体に拡張することで、糖鎖の有無による REUS シミュレーションからの自由エネルギー状況の違いについての理解が深まります。 開口部 RBD-A とその隣接する NTD-B 間の水素結合の平均数を 2 つの集合変数 d と ϕ の関数としてプロットしました。これは、RBD-A と NTD-B の間の相互作用の増加が制限に限定されないことを示しています。 MEPに沿った状態だけでなく、エネルギー障壁の+ d側の大きな領域も含まれています（図S4a）。 興味深いことに、RBD-A と NTD-B の間の水素結合の数は ϕ = 40∘ でピークに達し、ϕ が増加するにつれてゆっくりと減少します。これは、RBD-A が NTD-B から離れるとグリカンが介入してブロックするという以前の結果を反映しています。 2 つのドメイン間の相互作用。 エネルギー障壁の - d 側では、RBD-A と RBD-C の間の水素結合では逆のことが起こります。ここで、RBD-A と RBD-C は、ϕ が大きく、したがって最大の数をもつときに互いに最も近くなります。水素結合の関係（図S4b）。 この観察は、グリコシル化システムのエネルギー障壁を越えるときの MEP のねじれを説明します。 RBD-A を安定化する水素結合の数を最大化するために、スパイクは大きな ϕ でダウン状態のエネルギー井戸から出て、RBD-A と RBD-C の間の最大の接触を維持し、その後、エネルギー井戸に入るときに突然小さな ϕ に切り替わります。 NTD-B との接触を最大化するためのアップステート エネルギー井戸。

グリカンの長期スケールのダイナミクスを評価するために、グリコシル化システムと非グリコシル化システムの両方の 2 μs 平衡シミュレーションを 2 回実行しました。 REUS で使用される 2 つの集団変数に投影すると、両方のレプリカでダウン状態にある 3 つのプロトマーすべてが、グリカンの有無にかかわらずダウン構造のままでした (図 S5)。 平衡シミュレーション中にアップ状態とダウン状態の間の遷移は発生しませんでしたが、グリコシル化システムと非グリコシル化システムの両方で、アップ状態はダウン状態よりもはるかに高い柔軟性を示し、これは、見つかった 2 つのエネルギー井戸間のサイズの違いを反映しています。 REUS シミュレーションから。 興味深いことに、非グリコシル化 RBD-A は明らかな方向性の偏りなくアップ状態のエネルギー最小値付近でサンプルを採取しますが、グリコシル化 RBD-A は MEP に沿ってアップ状態の最小値から - d 方向に移動する傾向を示します。 この結果は、やはり REUS シミュレーションと一致しており、グリコシル化されたシステムのアップステートのエネルギー井戸は、エネルギー障壁から離れるよりもエネルギー障壁に向かう勾配が小さいのに対し、非グリコシル化システムのエネルギー井戸の勾配はより対称的であることを示しています (図 1)。 2c)。

また、平衡シミュレーションと MEP に沿った REUS 軌道を使用して、RBD-A 周囲のグリカン、つまり隣接する鎖 B の N165、N234、および N343 のグリカンの相互作用を分析しました。 最近、Amaro らは、スパイク開口部における上記のグリカンの個々の役割を研究するために、全原子 MD シミュレーションと突然変異実験を実施しました 26,32。 彼らの結果と一致して、スパイク開口中の N234 のグリカンの外側から内側へのスイングと、N343 のグリカンによるグリカン ゲート効果が観察されました (補足ムービー 2)。

私たちのシミュレーションでは、アップ状態とダウン状態の両方の安定化における N165 と N343 のグリカンの役割も明らかになりました。 具体的には、RBD-Aがダウン状態にある場合、N165とN343のグリカンがRBMを包み込み（図5a）、RBMをダウン状態に保ちます。 別の研究では、N370 のグリカンが人工的に導入されたときに同様の相互作用が観察されました。 それはダウン状態の RBD を「靴紐」のように巻き付けました21。 注目すべきことに、N165のグリカンは、露出したRBMの一部をサポートすることによってアップ状態のRBDも安定化します（図5b）。 N343 と N165 のグリカン間のグリカン間接触は、ダウン状態と比較してアップ状態で大幅に高く（図 S6）、N343 のグリカンが N165 のグリカンと相互作用することによって間接的にアップ状態を安定化していることを示唆しています（図 S6）。 5b)。 非グリコシル化システムの平衡シミュレーションの1つで観察されたように、2つのグリカンは、柔軟なRBMが隣接するダウン状態のRBDに付着してACE2にアクセスできなくなることも防ぎます（図S7）。

REUS トラジェクトリから抽出された S プロテイン a ダウン状態および b アップ状態における N165、N234、および N343 の S プロテイングリカンの代表的な位置。 c N165 (緑) および N343 (オレンジ) でグリカンと接触する、(上) ダウン状態および (下) アップ状態の RBD 残基の表面表現。 クロスハッチ パターンは、両方のグリカンとの接触を示します。 S タンパク質のアップ状態とダウン状態は MEP から選択されました。

上記の観察は、MEP に沿った REUS 軌道の接触解析によって確認されます。 RBD-AとN165およびN343のグリカン間の平均接触値で示されるように、N165およびN343のグリカンは両方ともダウン状態でRBMと相互作用します（図S8、S9）。 スパイクが開くと、N165のグリカンはRBMの下のRBD-A残基と相互作用するように切り替わりますが、N343のグリカンは、システムが開口の活性化障壁を通過した後、RBD-Aとほとんど接触しません（図5c）。 Sztain et al.32 によって以前に報告されているように、ダウン状態の接触分析では、グリカン ゲーティングに関与する RBM 残基 (F456、R457、Y489、および F490) も捕捉されます。

S タンパク質のクライオ EM 構造には、HR1 と CH の間の順番に位置する二重プロリン変異 K986P/V987P が含まれることがよくあります。 SARS-CoVとMERS-CoV、および他のクラスI融合タンパク質に関する以前の研究では、HR1-CHターンにこのプロリンペアが存在すると、融合前のスパイク構造が安定化し、タンパク質発現が増加することが確立されており、これらは両方ともワクチンの重要な側面である。デザイン49。 Cai et al.12 の S タンパク質構造は、安定化された融合前スパイクタンパク質の製造で一般的に行われる二重プロリン変異ではなく、WT K986/V987 配列を保持しています。 彼らは、以前に可溶化された細胞外ドメイン構造と比較して、S1 サブユニットが内側にシフトしている (したがって、より緊密にパッキングされている) ことを報告しています 12。 実際、隣接するプロトマー上の K986 とアスパラギン酸 (D427/D428) の間の推定上の塩橋の喪失は、可溶化された変異体構築物に見られる密集度の低い構造の生成に関係しています 12。 Gobeil ら 11 は、フリン部位が除去された D614 S タンパク質構築物では、プロリンの存在により、WT K986/V987 ペアと著しく類似した構造、ACE2 結合、熱安定性、および抗体結合が生成されると報告しています。 私たちの平衡シミュレーションでは、この塩橋の占有率は、2 つの独立した軌道の 3 つすべてのプロトマーの平均で約 30% でした。 前述の塩橋占有率の減少は、K986 と、約 15 ～ 25% の範囲で存在する近くの酸性残基 E748、E990、および D985 の間のプロトマー内塩橋との競合に由来しており、K986 と RBD アスパラギン酸の間の一時的な相互作用を示唆しています ( D427/D428）。 これらの競合する相互作用を図S10に示します。

非グリコシル化システムのジプロリン変異を使用して REUS シミュレーションを繰り返しました。 得られたPMFは、これらの祖先D614コンストラクトのWT PMF（図2b）で見られたものと同様に、アップ状態に有利​​なダウンRBD状態とアップRBD状態の間の適度なエネルギー差を示します（図S11）。 WTのエネルギー井戸と比較したダウン状態とアップ状態のエネルギー井戸の類似性（図2b）は、ジプロリン変異がこれらの非グリコシル化システムの相対集団にわずかな混乱しか生じないことを示唆しています。 最小値とは対照的に、ジプロリン変異体のバリアは増加していることが見られ、開口速度の調節が示唆されています。 K986 塩橋の一時的な性質と、RBD のダウン/アップ状態の相対エネルギーが同様であることを考慮すると、プロリン変異のさらなる影響は、α ヘリックスを破壊して歪ませる傾向である可能性があります。 HR1-CH ターン領域は、融合前状態から融合後状態への移行時に大きな構造変化を受け、延長された α-ヘリックスを形成します 12。 α-ヘリックスを破壊/ねじれることが知られている残基であるプロリンの存在は、融合後の立体構造に特徴的な長いα-ヘリックスの形成を阻害します49。 注目すべきことに、融合前状態から融合後状態への遷移を調査したWang et al.50による最近のシミュレーションでは、986/987のWT配列がらせん状になる傾向がある一方で、プロリンで置換するとこの二次状態の形成が妨げられることが示された。構造。

現在、SARS-CoV-2 S タンパク質を標的とする中和抗体が 1 万近く発見されています。 最も顕著な標的は S タンパク質 RBD 51,52 ですが、一部は NTD やその他の非 RBD エピトープを標的とするものもあります 53。 継続的に更新されている CoV-AbDab データベース 54 によると、合計 9906 個の (そして増加中の) 中和抗体が S タンパク質を標的としているのに対し、非 RBD エピトープを標的としているのは 3955 個だけです。 S タンパク質上の非 RBD エピトープをターゲットにする利点の 1 つは、RBD がダウン構造にある場合でも認識できることです 20,55。 対照的に、ダウン構造では RBD のグリカンが強力に覆われているため、RBD はアップ構造でのみ識別できます 26。

エピトープ露出に対するスパイク開口ダイナミクスの影響を理解するために、REUS から特定された MEP に沿った多数のエピトープのアクセス可能な表面積を計算しました。 我々は、RBD-A (隠れたエピトープを含む) および S タンパク質の NTD-B 上の複数の領域にわたるエピトープを持つ 7 つの異なる抗体 16、17、56、57、58、59、60 を選択しました。 これらの抗体の詳細を表S3に示します。 7 Å プローブを使用した同じサンプリング アプローチを使用して、グリカンを含めたり除外したりする抗体接触表面積 (AbASA) の計算を個別に実行しました。 以前の研究では、同様のプローブ サイズ 20 およびより小さいプローブ 33 が使用されました。 この適度な (7 Å) プローブ サイズにより、一部の隙間がわずかに露出しているように見える可能性がありますが 20、不可解なエピトープには最適です 33。

一般に、RBD-A がアップ状態に移行すると、AbASA は変わらないか、大幅に増加します。 STE90-C1159 抗体のエピトープは、下から上への移行中に AbASA にジャンプがあります。 CR3022 抗体は、ダウン状態では完全に覆われ、アップ状態ではわずかに露出するだけの隠れたエピトープ 57 に結合します。 タンパク質残基は、グリカンの有無にかかわらず、MEP のスパイク開口経路全体にわたってこのエピトープを同様にカバーします (図 S12)。 注目すべきことに、エピトープがRBM内に位置しているにもかかわらず、2-4抗体のAbASAはRBDの下から上への移行中に変化しない(図6a)。 したがって、アップ状態であっても RBM 全体が露出することはないと結論付けます。 4A8 抗体のエピトープの AbASA は、そのエピトープが構造変化を受けない N 末端 17 に位置するため、スパイクの開口中に大きく変化しません。 S2M11 のエピトープの AbASA は、スパイク開口経路に沿って変化しません。 さらに、S2M11 のエピトープの一部は隣接するプロトマーの RBD 上にあり、シミュレーションでは開いていません。 S2M11 抗体 60 のエピトープは 1 つのプロトマーの RBD (残基 440、441、および 444) とわずかに重複しますが、大部分は RBD 上の N322 の ACE2 グリカンの結合部位 (残基 369、371 ～ 374、および440）61． 驚くべきことに、S309 抗体のエピトープ 58 は、グリカンによる被覆率が増加することなく、アップ状態での露出が少なくなり（図 6b）、RBD の一部（表 S3）もアップ状態での露出が少なくなることを示しています。ダウン状態。

a タンパク質およびグリカンの存在下での抗体エピトープ (AbASA) 上の露出領域。 b グリカンありおよびなしで計算された 2 つの AbASA 値を差し引くことによって定量化された、MEP に沿ったグリカンによって覆われたエピトープの表面積。 アクセス可能な表面積の計算はすべて、7 Å プローブを使用して実行されました。

注目すべきことに、ここで選択された抗体のエピトープは、効果的な中和回避を伴う変異型変異の主要領域であるスパイクの NTD および RBD にあります 5,62,63。 影響を受ける抗体には、Omicron BA.162、64、65 による STE90-C11、4-8、S2M11、BD-368-2、および Omicron BA.2、BA.4/BA.563 による S309 エスケープの増加が含まれます。 後者の場合、中和の喪失には N343 グリカンの近位領域が関与しており、免疫応答におけるグリカンの重要な役割が強調されています。

SARS-CoV-2 感染は、ACE2 受容体が S タンパク質に結合すると開始され、S タンパク質はアップ状態とダウン状態の間で相互変換し、アップ状態のみが ACE2 結合を可能にします。 その結果、相互変換のエネルギー論が感染の開始を制御します。 この目的を達成するために、SARS-CoV-2 S タンパク質の上下相互変換の 2 次元エネルギーランドスケープを計算しました。 合計 160 μs の REUS 計算を使用して、開口ダイナミクスにおける S タンパク質グリカンの集合的な役割を解明します。 我々の結果は、完全にグリコシル化されていないスパイクと比較して、グリカンの存在下ではスパイク開口部の自由エネルギー障壁が約 7 kcal/mol 高いことを示しています。 グリカンの存在下では自由エネルギーはダウン状態に大きく有利ですが、S タンパク質の 2 つの状態間のエネルギー差は、グリカンが存在しない場合には統計誤差以下に減少しました。 より多くのアップステート S タンパク質が ACE2 受容体に結合する可能性が高く、そのためウイルスの適合性が高まると考える人もいるかもしれません。 しかし、先行研究 26,66 で示され、我々の分析でも再確認されたように、より多くのアップステート S タンパク質を持つことによる反対の効果がいくつかあります。 ダウン状態の RBD はグリカンによって強く保護されています 20,26 が、アップ状態では中和抗体にさらされやすくなります (図 6a)。 さらに、ACE2 の結合は、ACE2 と S タンパク質の間の結合親和性に強く依存しており、これにはタンパク質だけでなくグリカンとの相互作用が関与している可能性があります。 したがって、アップステート人口が多いことは、必ずしも ACE2 結合状態人口が多いことを反映するわけではありません。

ここおよび他の場所で説明されている原子レベルの説明26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36は、スパイクタンパク質の機能において動力学が果たす中心的な役割を考慮すると、特に関連性が高くなります。 クライオ EM 構造はこれらの状態を描写する上で中心的な役割を果たしていますが、それらの間の遷移や中間状態は利用できません。 MD は、改変されたグリカンの速度論的効果を含む、これらのタンパク質の機能のより完全な全体像を達成するために、これらの実験研究を補完するツールを提供します。 さらに、下流州と上流州の相対​​的な人口さえも不確実性がないわけではありません。 たとえば、Omicron 細胞外ドメイン変異体の最近のクライオ EM 構造は主に 1-up RBD 67 ですが、代替集団が報告されており 68、全長スパイクは 2-up/1-down RBD のアンサンブルをサポートしているようです 69。 このような立体構造の多様性は、おそらく代替構築物および/または実験条件の結果であると考えられます68。

スパイク上の抗体のエピトープは、タンパク質残基またはグリカンのいずれかによって保護でき、それぞれによって提供される被覆率は、スパイク開口経路に沿ってエピトープに依存して変化します。 STE90-C11 抗体は、RBD が上昇しているときにエピトープ露出が最も大きくなりますが、BD-368-2 抗体は、RBD の位置に関係なく、常に大幅に露出するエピトープを持ちます。 さらに、BD-368-2 エピトープの露出は、アップ状態の STE90-C11 のエピトープと非常に似ています。 したがって、これら 2 つの抗体は SARS-CoV-2 S タンパク質の中和において非常に高い効率を示し、どちらもサブナノモルの IC50 値を示します 56,59。 CR3022 抗体は潜在的なエピトープに結合します。 したがって、その AbASA は他のエピトープと比較して小さくなります。 しかし、露出した表面積の不足は、アップ状態であっても、エピトープと CR3022 の界面での強力な静電相互作用によって補われます 70。 S309 Fab は、N343 のグリカンを含むプロテオグリカン エピトープに結合することに注意してください。 ただし、S309 エピトープの大部分は RBM の一部ではないため、ダウン状態とアップ状態の両方でスパイクタンパク質に結合する可能性があります 58。 Omicron 変異体で観察されたように、この効果は N343 付近の変異によって無効になる可能性があります 63。

得られた 2 つの MEP (グリカンありとグリカンなし) を使用して、個々のグリカンと S タンパク質のさまざまなドメインの相互作用を分析しました。 N122 および N165 のグリカンは、開口部の RBD-A と隣接する NTD-B の間の水素結合を破壊し、アップ状態を不安定化するため、グリコシル化されていないシステムと比較した場合、平衡集団をダウン状態に向けて押し進めます。 N165 と N343 のグリカンも、RBM を包み込むことで RBD-A のダウン状態を安定化します。 逆に、N343 のグリカンは RBM32 を支えるいわゆる「グリカン ゲート」として機能し、N165 のグリカンは N343 のグリカンを利用してアップステート RBD-A をサポートするのに役立ちます。 その結果、これら 2 つのグリカンはダウン状態とアップ状態の両方を安定化し、それぞれの局所的なエネルギー最小化に貢献します。 N165 におけるグリカンの複雑な役割は、N165A 変異がスパイク結合を増加させるか減少させるかに関する矛盾する実験結果を説明する可能性があります 26,71。

スパイクタンパク質は中和抗体の主な標的であり、ダウン状態とアップ状態でさまざまなエピトープを提示し、現在のワクチンとブースターの基礎となっています5、15、16、17。 進化の圧力の下では、スパイクは急速に変異しており、抗体の逃走が増加した、より伝染性の高い変異体が出現します5。 ウイルスは変異を続けていますが、これまでのところ、ワクチンと追加免疫が十分な防御を提供しているようです。 長引くパンデミックを治療するための効果的なアプローチは、特にスパイクが変異を続け、免疫機能を侵害する可能性があると思われるため、ダウン状態とアップ状態の両方、およびそれらの間の移行におけるスパイク上の重要な免疫学的領域の特定と評価であり続ける。現在のワクチン/ブースター。 SARS-CoV-2 スパイク変異体について報告されている構造と動態の変化 11,25,67,68 を考慮すると、スパイクタンパク質の開口に関するエネルギー論と動態の詳細な説明が必要であり、ここで説明するような計算によるアプローチは、貴重な補完的な情報を提供します。効果的な治療法を開発するためのツールです。

最後に、我々は、開口プロセスにおけるグリカンの役割を原子レベルで洞察し、SARS-CoV-2 S タンパク質のスパイク開口経路に沿ったエネルギー論を計算しました。 さらに、スパイク開口エネルギーが ACE2 結合とエピトープ露出の動態にどのような影響を与えるかを強調しました。 これらの発見、特にスパイク開口経路に沿った立体構造は、進行中の新型コロナウイルス感染症危機と戦うための効果的なナノボディや抗体の設計を容易にするだろう。

我々は、Walls et al.10 (PDB: 6VYB) および Cai et al.12 (PDB: 6XR8) によるクライオ電子顕微鏡 (cryo-EM) 構造に基づいて、VMD72 を使用してアップ状態とダウン状態をモデル化しました。 Cai らによって報告されたダウン状態構造。 は、2.9 Å の分解能で界面活性剤で精製された全長 WT S タンパク質構築物です12。 これは、以前に報告された構造といくつかの重要な違いを示します: (i) N17 にグリコシル化部位が追加された、より分解された NTD、(ii) 融合前安定化 2PP 変異ではなく、中央ヘリックス/ループ領域の WT 配列、および ( iii) 以前は未解決だった約 25 残基長のセグメント、残基 828 ～ 853。 この後者の領域は、D614 の塩橋パートナーを提供する重要なリジン (K854) に隣接しています。 この塩橋の喪失は、D614G SARS-CoV-2 株の感染力の増加に関係しています。 さらに、Cai ら 12 は、これまで欠落していた 2 つのジスルフィド結合も解決しました。1 つは N 末端 (C15 ～ C136)、もう 1 つは中央ヘリックス/ループ領域 (C840 ～ C851) です。 私たちのモデルでは、6XR8​​ 構造をテンプレートとして使用し、SWISS モデル 73 でダウン状態構造の欠落残基が追加されました。 モデルは、残基 R685 と S686 の間のフューリン切断部位で切断されました。 RBD と NTD を含む S1 部分は、6VXX と比較して 6XR8 構造に密に詰め込まれており、HR1 と CH を含む S2 部分はそれらの間に配置されています12。 私たちのモデルの S1 部分と S2 部分には、それぞれ残基 N14 ～ R685 と S686 ～ S1147 が含まれています。 10 個のジスルフィド結合が、残基 C15-C136、C131-C166、C291-C301、C336-C361、C379-C432、C391-C525、C480-C488、C538-C590、C617-C649、および C662-の間の S1 部分に追加されます。 S2パートC738～C760、C743～C749、C840～C851、C1032～C1043、C1082～C1126にC671と5が追加されます。 アップ状態で欠落している部分は、最小化されたダウン状態モデルを使用してモデル化されました。 グリコシル化部位は、N17、N61、N74、N122、N149、N165、N234、N282、T323、N331、N343、N603、N616、N657、N709、N717、N801、N1074、N1098、および N1134 にあります。 全体として、各プロトマーには 19 個の N 結合型グリカンと 1 個の O 結合型グリカンが存在し、1 つの S タンパク質三量体モデルに対して合計 60 個のグリカンが存在します。 Chrispin ら 19 による質量分析データで最も多く存在する各部位のグリカンは、Woods グループ (http://glycam.org) が開発した GLYCAM Web サーバーを使用してサイトに追加されました 37,38。 グリカン組成を図S13に示します。 欠落した水素原子がすべての系に追加され、その後、195 × 193 × 212 Å3 の水ボックス内で溶媒和されました。 Na+ イオンと Cl- イオンを追加して、約 0.150 M の塩濃度を達成しました。タンパク質、水、グリカン、およびイオンの原子数は、REUS 計算では同じに保たれました。 システム (アップ状態またはダウン状態) には、グリカンありとなしで、それぞれ合計 758,531 個の原子 (タンパク質原子およびグリカン原子 63,312 個、Na+ 661 個、Cl- 652 個) と 633,864 個の原子 (タンパク質原子 52,476 個、Na+ 549 個、Cl- 546 個) が含まれています。 イオン数の違いは、（1）グリカンを収容するために必要なより大きな水ボックス、および（2）O-結合型グリカンに存在するシアル酸（図S13でNeu5Acと標識）の負電荷から生じます。

すべてのシミュレーションは、CHARMM36m タンパク質力場 76、CHARMM36 グリカン力場 77、および TIP3P 水 78 を備えた NAMD 2.1474,75 を使用して実行されました。 各システムは、ランジュバン力学とピストン 79 をそれぞれ使用して、温度と圧力をそれぞれ 310 K と 1 atm に固定して 5 ns 間平衡化しました。 水素質量再分配 (HMR) の使用により、均一な 4-fs 時間ステップが採用されました 80,81。 長距離静電気量は、粒子メッシュ Ewald 法 82 を使用して時間ステップごとに計算されました。 レナード・ジョーンズ相互作用の短距離カットオフは 12 Å に設定され、スイッチング関数は 10 Å から始まります。 水素原子が関与する結合は、水分子には SETTLE アルゴリズムを、その他すべてには SHAKE アルゴリズムを使用して、平衡長に制限されました。

平衡化後、各システム（グリコシル化WT、グリコシル化されていないWT、およびジプロリン変異を伴う非グリコシル化）の2つの集合変数dおよびϕ（図1で定義）に沿って2つの独立したメタダイナミクスシミュレーションを実行しました。アップ状態からの 1 つ。 NAMD の Colvars モジュールは、すべての集合変数を構築するために使用されました 83。 バイアスは、丘の高さ 0.2 kcal/mol、幅 d および ϕ それぞれ 1.0 Å および 1.0 ∘、および 1 ps-1 の速度で堆積されました。 システムは、ダウン (PDB: 6XR8) 状態とアップ (PDB: 6VYB) 状態のクライオ EM 構造の範囲内の d と φ に限定されました。 ランジュバン力学を使用して温度を 310 K に保ち、体積を一定に保ちました。

次に、メタダイナミクスの軌跡を使用して、次の手順に従って REUS 実行をシードしました。 システムごとに、2 つの予備的な PMF が生成されました。1 つはダウンステートのメタダイナミクスから、もう 1 つはアップステートのメタダイナミクスから生成されました。 構造空間は小さなグリッドに分割され、各グリッドは次の段階で単一の REUS ウィンドウになりました。 ダウン状態とアップ状態の両方のメタダイナミクスからの PMF が特定のしきい値 (表 S2) を下回るウィンドウはドロップされ、REUS シミュレーションでは使用されません。 残りのグリッドについては、それぞれの PMF のボルツマン重みに従って、ダウン状態 (Fdown) またはアップ状態 (Fup) のメタダイナミクス軌道からスナップショットを選択しました。

Pdown > Pup の場合、ダウン状態のメタダイナミクス軌道からのスナップショットがそのグリッドに対して選択され、その逆も同様です。 これにより、WT グリコシル化システム用に 387 のウィンドウ (下から 181、上から 206) が選択されました。 WT 非グリコシル化システムでは 392 ウィンドウ (下から 79、上から 313)。 ジプロリン変異を伴う非グリコシル化システムでは 353 ウィンドウ (下から 119、上から 234)。

グリコシル化されたシステムについては、メタダイナミクス シミュレーションから抽出されたすべてのスナップショットのグリカンに対してシミュレーテッド アニーリングをさらに実行しました。 1000 K から開始して、システムを 823 K、677 K、557 K、458 K、377 K、および 310 K のステップで生理学的温度までゆっくりと冷却しました。各温度を 2 ns 実行しました。 シミュレーション中、すべてのタンパク質原子は固定され、グリカン、水分子、イオンは自由に移動できました。 1000 K および 823 K では原子の速度が速いため、HMR とともに 2 fs の時間ステップが使用されました。 677 K 以下の温度では、HMR で 4 fs の時間ステップが使用されました。 他のシミュレーション パラメーターは以前に使用したものと同じです。 グリカンの最終的な環構造は、期待値と一致することが確認されました (図 S14)。

初期構成を準備した後、メタダイナミクス シミュレーション PMF に従って選択された領域内で、d および ϕ に沿って各システムの REUS シミュレーションを実行しました。 d と ϕ の範囲は、それぞれ 44.0 Å ～ 72.5 Å と –56.0∘ ～ 1.0∘ です。 d およびウィンドウの中心に沿った拘束力の定数は、隣接するウィンドウ間の十分な重なりと交換を確保するために調整されました。 ϕ に沿った力定数は 1.0 kcal mol−1deg−2 で一定に保たれました。 WT グリコシル化システム、WT 非グリコシル化システム、およびジプロリン変異を伴う非グリコシル化システムの REUS シミュレーションを、それぞれ 32 ns、36 ns、および 29 ns 実行しました。 シミュレーションパラメータはメタダイナミクスシミュレーションで使用したものと同一でした。 REUS からのサンプリング データは、Python モジュール pymbar84 に実装されている Multistate Bennett Acceptance Ratio (MBAR) を使用して各システムの PMF を計算するために使用されました。 WT グリコシル化システムと非グリコシル化システムについては、メタダイナミクス シミュレーションと同様の方法で、前のラウンドから抽出したスナップショットを使用して、さらに 3 ラウンドの REUS シミュレーションを実行しました。 2 回目のラウンドでは、REUS の 1 回目のラウンドで計算された PMF に基づく新しいエネルギー カットオフを使用して、シミュレーション領域が再選択されました (表 S2)。 拘束力の定数と窓の中心も再調整されました。 WT グリコシル化システムおよび非グリコシル化システムに対する REUS の 2 回目のラウンドは、それぞれ 37 ns および 56 ns 実行されました。 REUS の第 2 ラウンドの結果を考慮して、2 つのエネルギー井戸を完全にカバーするように PMF 領域を拡大して、REUS の第 3 ラウンドを実行しました。 第 3 ラウンドでは、各エネルギー井戸に対して 2 つの独立した REUS シミュレーションが実行されました。 ダウン状態 REUS の場合、d と ϕ の範囲はそれぞれ 40.5 Å ～ 51.0 Å と –66.5∘ ～ –21.5∘ でした。 アップステート REUS の d と ϕ の範囲は、それぞれ 57.5 Å ～ 99.5 Å と –35.5∘ ～ 45.5∘ でした。 新しいメタダイナミクス シミュレーションは、以前の REUS シミュレーションでは決してサンプリングされなかったシード領域に対して実行されました。 ここでも、新しいエネルギーカットオフ (表 S2) に基づいてウィンドウが選択され、隣接するウィンドウ間の重なりと交換を最大化するように拘束力定数とウィンドウの中心が校正されました。 WT グリコシル化ダウン状態およびアップ状態システムの 3 回目の REUS は、それぞれ 16 ns および 12 ns 実行され、非グリコシル化システムの REUS はそれぞれ 33 ns および 28 ns でした。 最後に、ダウン状態からアップ状態までの全範囲をカバーするために REUS の最終ラウンドが実行されました。 ラウンド 2 と 3 のすべてのウィンドウが採用され、すべての低エネルギー領域が確実にカバーされるようにエッジにいくつかのウィンドウが追加されました (表 S2)。 WT 非グリコシル化システムの REUS は、REUS の前のラウンドからの最後のフレームを直接使用して 36 ns 実行されました。 グリコシル化システムの場合、エネルギー障壁の周囲のウィンドウに非グリコシル化 REUS から新しいシーディング構造を生成し、グリコシル化 REUS シミュレーションにおけるダウン状態とアップ状態の構造間のギャップを埋めるのに役立ちます。 前回の REUS ラウンドの構造と、完了した非グリコシル化 REUS シミュレーションから新しく生成された構造を使用して、グリコシル化 REUS を 36 ns 実行しました。 WT システムについて提示されたデータは、REUS の 2 回目から最後のラウンドまでのデータの組み合わせに基づいています。 WT 糖鎖付加系、WT 非糖鎖付加系、およびジプロリン変異 REUS を有する非糖鎖付加系で使用したシミュレーション データの総集計時間は、それぞれ 65 μs、91 μs、12 μs でした。

平衡シミュレーションでは、異なるランダム シードで初期化された 2 つのレプリカが実行されました。 さらに、MBAR が提供する不確実性を使用して PMF の収束を評価したところ、PMF の端付近を除いてすべて 0.2 kcal/mol 未満でした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

図 2 の PMF のソース データは補足データ 1 として提供されています。S タンパク質の立体構造、3 つの PMF それぞれの MEP、および NAMD 構成ファイルは、https の NSF MolSSI COVID-19 Molecular Structure and Therapeutics Hub で入手できます。 ://covid.molssi.org/simulations/#pmf-calculations-of-sars-cov-2-spike-opening。

VMD と NAMD は、それぞれ https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/ と https://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/ で入手できます。 使用される MBAR 実装は https://github.com/choderalab/pymbar で入手できます。

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オークリッジ国立研究所のサミット スーパーコンピューターのコンピューター時間の賞は、新型コロナウイルス感染症ハイ パフォーマンス コンピューティング コンソーシアムを通じて提供されました。 追加の計算リソースは、米国科学財団 (NSF; ACI-1548562) によってサポートされている Extreme Science and Engineering Discovery Environment (XSEDE; TG-MCB130173) を通じて提供されました。 この作業では、Hive クラスターも使用しました。このクラスターは、NSF によって助成番号 1828187 でサポートされ、ジョージア工科大学の高度なコンピューティング環境のためのパートナーシップ (PACE) によって管理されています。 著者らは、平均初回通過時間の計算に関する指導をしていただいた Mahmoud Moradi 氏に感謝します。 YTP は、テキサス アドバンスト コンピューティング センター (TACC) のフロンテラ フェローシップによってサポートされています。 Frontera は、NSF 助成金番号 OAC-1818253 によってサポートされています。

アタヌ・アチャリヤ

現在の住所: BioInspired Syracuse およびシラキュース大学化学科、シラキュース、ニューヨーク州、13244、米国

これらの著者は同様に貢献しました：Yui Tik Pang、Atanu Acharya。

ジョージア工科大学物理学部、アトランタ、ジョージア州、30332、米国

ユイ・ティク・パン、アタヌ・アチャリヤ、ダイアン・L・リンチ、アンナ・パブロワ、ジェームズ・C・ガンバート

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YTP、AA、DLL、および JCG が設計した調査。 YTP、AA、DLL、AP は調査を実施し、データを分析しました。 そして著者全員が原稿を書きました。

ジェームズ・C・ガンバートへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Elisa Fadda、Peter Coveney、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: Gene Chong。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Pang、YT、Acharya、A.、Lynch、DL 他。 SARS-CoV-2 のスパイク開口部のダイナミクスとエネルギー論は、グリカンの個々の役割とその全体的な影響を明らかにします。 Commun Biol 5、1170 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04138-6

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受信日: 2021 年 9 月 1 日

受理日: 2022 年 10 月 20 日

公開日: 2022 年 11 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04138-6

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