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Aug 05, 2023

ワクシニア

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 14、記事番号: 1770 (2023) この記事を引用

2697 アクセス

66 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細菌または酵母のディスプレイシステムにおける指向性進化は、構造的および生物物理学的研究のための G タンパク質共役受容体の安定性と発現を改善するために成功裏に使用されています。 しかし、いくつかの受容体は、その複雑な分子組成やリガンドの好ましくない特性のため、微生物系で取り組むことができません。 今回我々は、哺乳動物細胞においてGタンパク質共役受容体を進化させるアプローチを報告する。 クローン性と均一な発現を達成するために、ワクシニアウイルスに基づくウイルス形質導入システムを開発します。 合成 DNA ライブラリーの合理的な設計により、まず、高い安定性と発現を実現するニューロテンシン受容体 1 を進化させます。 第二に、副甲状腺ホルモン 1 受容体など、複雑な分子構造と大きなリガンドを持つ受容体が容易に進化できることを示します。 重要なことは、哺乳動物のシグナル伝達環境の存在下で機能的な受容体の特性を進化させることができ、その結果、リガンド結合部位とGタンパク質界面の間のアロステリック結合の増加を示す受容体変異体が得られることです。 したがって、我々のアプローチは、GPCR活性化に必要な複雑な分子相互作用についての洞察を提供します。

G タンパク質共役受容体 (GPCR) は、内在性膜タンパク質の最大のファミリーを構成し、多くの生物学的プロセスの制御に関与しています1。 GPCR は、小分子から大きなタンパク質に至るまで、細胞外側で多種多様なリガンドを感知します。 機能を発揮するために、GPCR は連続した構造状態をサンプリングし、その結果、無活性から最大活性までのレベルが得られます。 リガンドは、受容体を不活性状態（インバースアゴニストの場合）または活性状態（アゴニストの場合）に保つ、異なる立体構造を安定化します2。 アゴニストによってリガンド結合ポケットに誘発される構造変化は、受容体の細胞内表面に伝達され、Gαサブユニット内のGDPとGTPの交換によりヘテロ三量体Gタンパク質が活性化されます。 その結果、Gα サブユニットと Gβγ サブユニットが解離し、下流のシグナル伝達プロセスを活性化する可能性があります 3,4。 GPCR は生理学的に広範な関連性があるため、重要な薬剤標的であり 1、GPCR の活性化につながる構造機能メカニズムを理解することは、将来の薬剤開発にとって重要です。 立体構造の柔軟性は受容体が適切に機能するために不可欠ですが、タンパク質の構造を実験的に決定するには障害となります。 これは、GPCR を構造研究に適したものにするための実質的な工学的努力の動機となっています。

我々はこれまでに、GPCR の生物物理学的特性を改善するために指向性進化を使用したいくつかの戦略を考案しました 5、6、7、8。 指向性進化は、遺伝子の多様化と選択を繰り返すことによって、自然進化のプロセスを加速すること、つまり、遺伝子変異のプールにコード化されている望ましい形質を強化することを目的としています。 これにより、タンパク質の機能を新たに変更または作成することができるため、指向性進化は新しい分子ツールや治療法を開発するための強力な方法となっていますが、主に可溶性タンパク質に適用されています。 この方法論を GPCR に拡張するために、細菌や酵母などの微生物が使用されました。 プラスミドによる形質転換により、微生物細胞は平均して 1 コピーを取り込むことができるため、プラスミドがそのコピー数を確立した後も、各微生物細胞は依然として「クローン性」のままです。 酵母の原形質膜または大腸菌の内膜における機能的な形での GPCR の発現が示されており 5、8、9 、したがって、指向性進化の重要な要件である表現型と遺伝子型の厳密な結合が保証されています。 さらに、微生物において高い形質転換率を達成して、多様な遺伝子ライブラリを効率的に表現することができます。 リガンド結合、つまり膜内の機能的な受容体の数によって駆動される選択を使用して、構造研究や創薬プロジェクトに役立つ、発現性が高く安定したさまざまな GPCR バリアントが生成されました 10、11、12、13、14、15。 16、17。

細菌および酵母における処理効率とライブラリー生成は非常に適していますが、膜タンパク質への適用に関して微生物発現システムにはいくつかの基本的な制限が伴います。 微生物の原形質膜は通常、外膜または細胞壁によって保護されているため、特に大きなリガンドの場合、受容体のリガンド結合部位に細胞外側から容易にアクセスすることができません。 これらの外側の障壁を小分子や短いペプチドリガンドに対して透過性にするための効率的な透過処理プロトコルが考案されています5、6、8。しかし、ペプチドホルモンやタンパク質などのより大きな分子は、受容体の結合部位に容易に到達できない可能性があります。 また、多くの GPCR は細菌や酵母細胞に対して毒性が高く、選択には最小限の基礎発現が必要であるため、進化する可能性のある標的の数が制限されます。 最後に、受容体の機能、つまり下流のエフェクターにシグナルを伝達する可能性は、内因性シグナル伝達カスケードが完全に欠落している（細菌の場合）か、非常に低い機能しか存在しない（酵母の場合）ため、微生物系では容易に対処することができません。 ）。 したがって、微生物系における GPCR の進化は、これまで受容体の発現と安定性の改善に限定されており、GPCR シグナル伝達の機能的側面を探索するために指向性進化の可能性を応用する可能性はまだ開かれていません。

対照的に、哺乳類細胞ではそのような制限は存在しないため、哺乳類ディスプレイシステムはリガンドと受容体の組み合わせに新たな可能性を開く可能性があります。 しかし、大規模なライブラリーの作成の容易さを微生物ディスプレイシステムから哺乳類細胞に移すことは困難でした。 哺乳類のライブラリーを作成する多くの試みは、感染多重度が低いレンチウイルスベクターに依存してきました18。 それらは HIV ゲノムに由来し、そのゲノムは宿主ゲノムに挿入されます。 これにより安定したライブラリーが作成されますが、このアプローチにはかなりの欠点があります。ライブラリーの最大多様性は制限され、挿入点によって少なくとも変異体の表現型と同じくらい発現レベルが決まり、発現レベルは遺伝子コピー数と同じくらい低くなります。は非常に低く、DNA は単一細胞 PCR からのみ取得できるため、タンパク質変異体の同定はかなり面倒です。 さらに、挿入された導入遺伝子は、かなり予測不可能な方法で沈黙する可能性があります。 最近のアプローチでは、ウイルスベクターに依存しない CRISPR/CAS 技術または専用のインテグラーゼ システムが使用されていますが、現時点ではライブラリーのサイズが制限されています 19、20、21。 他の方法は、継続的な指向性進化に依存しており、忠実度の低いウイルスベクターが使用され、ウイルス複製中に永久変異誘発が引き起こされます。 これにより、多様な組換えウイルス ライブラリーを作成するという課題は克服されますが、そのようなシステムは制御が難しく、効率的な選択体制が必要です 22,23。

ここでは、ワクシニアベクターに基づいた、GPCR の指向性進化のための哺乳動物選択システムを紹介します。 これにより、その後の発現誘導選択に不可欠な GPCR の均一な発現をもたらす、非常に多様なライブラリーを容易に生成できます。 我々は、このシステムをクラスAおよびBからGPCRを進化させるために採用し、合理的なライブラリ設計と組み合わせることで、高度に安定化された受容体変異体の生成から受容体シグナル伝達特性の調節に至るまで、GPCR特性の広範な操作にこのシステムを使用できることを実証しました。

目的の遺伝子のモノクローナルかつ均一な発現は、定向進化における選択の重要な前提条件ですが、一過性トランスフェクションなどの一般的な発現戦略では哺乳動物細胞で達成するのは困難です。 等しい遺伝子量とクローン性の両方を達成するには、細胞は単一のベクター分子を取り込み、それをすべての細胞で同様のコピー数まで複製する必要があります。 したがって、我々は、ワクシニアウイルスにおいて多様なcDNAライブラリーを生成するために最近考案したベクターシステムを採用した24,25。 ワクシニアウイルスは約 180 kDa の線状 DNA ゲノムを持ち、細胞質内で複製されてパッケージ化されます。 したがって、ベクターからの遺伝子発現は細胞間で均一であり、選択された非常に少数の細胞からも特定の組換え体を容易に回収できます。

均一な GPCR 発現がワクシニア ベクターで達成できるかどうかをテストするために、ニューロテンシン受容体 1 (NTR1) のいくつかの変異体の発現を評価しました。 A-431 細胞には、細胞あたり 1 pfu の MOI で組換えウイルスを感染させ、それによって細胞あたり 1 つのウイルス粒子の平均分布を確保しました。 感染から 16 ～ 18 時間後に細胞を回収し、蛍光標識リガンド NT(8 ～ 13) を使用してフローサイトメトリーで受容体の発現を分析し、同じ受容体構築物で一時的にトランスフェクトされた CHO 細胞と比較しました。 ワクシニア感染細胞は、狭い分布で均一な発現レベルを示しました（図1a）。 したがって、野生型 NTR1 と、大腸菌での機能発現を高めるために以前に進化した 2 つの変異体 NTR1-TM86V および NTR1-L5X との間の受容体発現における明確な区別が可能でした 26。 対照的に、一過性にトランスフェクトされた細胞における受容体変異体の発現は、各構築物の発現レベルの広範囲な分布をもたらし、したがって、細胞によって取り込まれたプラスミドの量の変化を反映している（図１ａ）。 したがって、ワクシニアベースの発現系は、哺乳動物細胞における GPCR の均一な発現を可能にし、異なる発現レベルを持つ変異体間の明確な識別を可能にします。 指向性進化に必要な大きくて多様な cDNA ライブラリーを作成するために、三分子組換えと呼ばれる特異的な組換え戦略が開発されました 24。 ここでは、分割されたワクシニアゲノムが、選択マーカーとともに目的の遺伝子を保持する 3 番目のフラグメントで補完されます。 3 つのフラグメントすべてが組み換えられた場合にのみ、生産的なウイルス粒子が形成されます。 その結果、非組換えウイルスのバックグラウンドはほぼゼロとなり、数百万もの異なるワクシニア組換え体を含むライブラリーの構築が可能になります24。 これらの結果に基づいて、細菌および酵母細胞における発現誘導進化にヒントを得た、哺乳類細胞における GPCR の誘導進化のための選択プラットフォームを考案しました 5,8 (図 1b)。

a プラスミドでトランスフェクトした哺乳動物細胞とワクシニアで形質導入した哺乳動物細胞における GPCR 発現の比較。 一過性にトランスフェクトされたCHO細胞(右上パネル)、ワクシニアウイルス構築物に感染したA431細胞(右下パネル)。 ネガティブコントロール（灰色の網掛け）、NTR1（黒線）、NTR1-TM86V（赤線）およびNTR1-L5X（青線）を示す。 b ワクシニアウイルスを使用した哺乳類細胞における指向性進化のワークフロー。 GPCR DNA ライブラリーの合成後、Trimolecular Recombination24 によってワクシニア ウイルス ライブラリーが作成されます (左の挿入図; 黄色、組換え対象のウイルスに相同な領域、青、目的の遺伝子)。 この目的のために、まずランダム化された GPCR DNA ライブラリーをワクシニア ウイルス導入プラスミドにクローン化します。 次に、GPCR 遺伝子は消化されたワクシニア ウイルス DNA と組み換えられ、鶏痘ヘルパー ウイルスを使用して感染性ウイルス粒子がパッケージングされます。 ウイルス ライブラリを使用して、細胞あたり 1 ウイルスの感染多重度で A-431 細胞を一晩感染させ、5 ～ 10 の冗長性でライブラリの多様性をカバーします。 哺乳動物細胞の原形質膜は細胞外空間 (ECS) から容易にアクセスできるため、発現した受容体を選択した蛍光リガンドで直接標識できます。 より高い受容体密度を有する細胞は、より高いリガンド結合を示し、したがってより高い蛍光を示し、その後、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって選別される。 選別後、細胞を機械的に溶解してウイルスを放出し、新鮮なフィーダー細胞上でウイルスを増幅させます。 分類されたウイルス プールは、その後の選択ラウンドでの感染に使用できます。

まず、我々は、哺乳類システムの能力を、微生物細胞におけるこれまでの指向進化アプローチからの選択と比較することを目的とした。 したがって、我々は NTR1 を選択しました。これは、以前の研究で 4 つの異なる微生物選択システムでこの受容体を調査しており、いずれも GPCR のより高い安定性とより高い機能発現の両方で成功した選択を示しているためです 5、6、7、8。 エラープローン PCR によって完全にランダムなライブラリーを作成する代わりに、突然変異の位置とタイプを容易に制御できる合成ライブラリーを生成するために、半合理的なアプローチが採用されました。 NTR1 結晶構造 (PDB ID: 4BUO)10 に基づいて、ヘリックス-ヘリックス接触に関与する可能性が最も高い残基がランダム化のために選択されましたが、脂質膜環境に面している残基、またはリガンドまたは G タンパク質の相互作用に関与している可能性のある残基は除外されました。 。 合計 94 個の残基がランダム化のために選択されました。 突然変異誘発は、クラスA GPCRの各位置で最も一般的なアミノ酸を含む系統発生的置換マトリックスに由来する、各位置の事前に定義された置換基のセットに限定されました（補足図1、補足注記を参照）。 選択結果を微生物ディスプレイシステムで実施した以前のキャンペーンと同等にするために、受容体をその同族Gタンパク質から最初から切り離すことを決定しました。これにより、受容体とGタンパク質の相互作用の潜在的な影響を防ぎます。これは哺乳動物細胞では可能ですが、細胞では可能ではありません。微生物細胞、選択結果について。 この目的のために、ライブラリ全体で R1673.50 を Leu に変異させました。それ以外の場合は野生型 rNTR1 に基づいていました。 L1673.50は、Gタンパク質のカップリングに必要な保存されたD/ERYモチーフを破壊し、受容体を不活性状態に固定します14、27、28、29（補足図1）。

得られた cDNA ライブラリには、ランダム化された各位置に平均 2.9% の変異が含まれており、遺伝子あたり平均 2.8 個の変異が生じました (補足図 1d、e)。 この合成ライブラリーから、1.3 × 108 の多様性をもたらすウイルス ライブラリーを三分子組換えによって作成し、A-431 細胞を MOI 1 で感染させました。以前の微生物受容体の進化と同様に、機能発現レベルに基づいて選択が実行されました。 この目的のために、受容体発現細胞を飽和濃度の蛍光標識NT(8-13)とともにインキュベートし、FACSに供して、最も高い蛍光レベル（すなわち、最も高い受容体発現）を有する細胞を濃縮した。 各選別ラウンドの後、ウイルスは濃縮された細胞プールから直接単離され、増幅され、その後の選択ラウンドのために新鮮な細胞バッチに感染するために使用されました（図1b）。 合計で 2 回の選択ラウンドが、それぞれ上位 0.5% と 0.06% の蛍光細胞をゲートすることによって実行されました。 各選択ラウンドの後、選別された集団の蛍光シグナルの右へのシフトが観察され、選択されたプールにおける受容体発現レベルがより高いことが示されました（図2a）。 各選択プールから、NTR1 cDNA を PCR によって増幅し、哺乳動物発現ベクターにサブクローニングして配列決定しました。 94個のクローンが単離され、受容体発現レベルについてスクリーニングされ、最もよく発現している25個のクローンがさらに分析されました。 全体として、発現レベルは野生型 NTR1 の 25 ～ 82 倍であり、大腸菌によって進化した変異体が到達するレベルと同等かそれを超えていました 26。 対照的に、基礎となる変異体 NTR1-R167L は、野生型 NTR1 と比較して 2.5 倍の発現増加のみを示しました。これは、選択圧力が成功し、発現増加の大部分が選択中に蓄積されたことを示しています（図 2b、補足表 1）。 。

a 改良型 NTR1 バリアントのソート ゲート (左パネル)。 上位 0.5% の蛍光細胞のソーティング ゲートは赤い輪郭で示されます。 増幅後の1回目と2回目のソート集団を野生型と比較したヒストグラム（右パネル）：ソート1（赤線）、ソート2（青線）、NTR1（黒線）、ネガティブコントロール（濃い灰色の網掛け）。 b 25 の進化した NTR1 バリアントの発現分析。 HEK293T 細胞における受容体の発現は、飽和濃度の HL488-NT(8-13) を用いたフローサイトメトリー分析によって評価されました。 発現レベルは野生型受容体の発現と比較し、2回の独立した実験の平均値±標準誤差として与えられます。 c 25 の進化した NTR1 変異体のリガンド親和性。 IC50 値は、NT(8-13) を用いた全細胞リガンド競合結合実験から得られました。 バーは、それぞれ技術的に重複して行われた3つの独立した実験からの野生型受容体と比較した、各変異体の計算された親和性（ΔpIC50）の平均変化±semを表します（補足表1）。 d 受容体の発現と熱安定性の間の相関関係。 7 つの NTR1 変異体の熱安定性を細胞膜画分で評価し、(b) の発現レベルに対する野生型受容体からのリガンド結合によって測定された融解温度 (ΔTm) の変化としてプロットしました。 データは、二重に実行された2〜3の独立した実験の平均値±semを表します（補足表1）。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

R1673.50L変異体と同様に、この変異を含むすべての進化したNTR1変異体のシグナル伝達は強く損なわれ、最良の変異体では野生型NTR1の有効性のわずか35％に達しました（補足図2、補足表1）。 。 したがって、一般的な R1673.50L 変異は、進化によって克服できない受容体の機能に強い影響を及ぼしました。 R1673.50L変異単独ではNT（8-13）に対する親和性が約3倍増加しましたが、進化した受容体変異体は最大30倍のアゴニスト親和性の増加を示しました（図2c、補足表1）。 オルソステリック結合部位に直接変異が存在しない場合、および G タンパク質共役が存在しない場合に高い親和性が達成されるというこの明らかな矛盾は、大腸菌で進化した他のいくつかの NTR1 変異体および他の手段で安定化された一部の受容体変異体でも観察されています10。 、14、26、30。 これは、高親和性結合を示すにもかかわらず、DRY マイクロスイッチの破壊と受容体の不活性立体構造での安定化による、アゴニスト結合部位と細胞内 G タンパク質界面の間のアロステリック結合の破壊の結果である可能性があります 27,31。 これは、いくつかのクローンの熱安定性を分析したときにさらに裏付けられました。 テストした7つの変異体はすべて強力に安定化しており、その融解温度は野生型NTR1よりも4〜10℃高い範囲でしたが、R1673.50L変異単独では熱安定性に影響はありませんでした（補足表2）。 大腸菌26で行われた以前の進化キャンペーンと同様に、ここでも発現レベルと熱安定性の間に強い正の相関が観察されました（図2d）。 配列分析により、変異ごとに 5 ～ 8 個の変異が明らかになりました。 3 つの変異ホットスポット、A1553.38T、Q2395.36T、および N3657.49K が、それぞれクローンの 56%、96%、および 80% に存在し、これらの残基のそれぞれに対する強い選択圧力が示唆されました (補足図 3)。 ）。 A1553.38T および Q2395.36T はクラス A GPCR では保存されず、熱安定性の向上との明確な相関関係はありません。 高度に保存された N3657.49 は NPxxY マイクロスイッチの一部であり、クラス A GPCR の D2.50 によって構成されるアロステリック ナトリウム部位に結合しており、どちらもシグナル伝播の重要なメディエーターです。 D2.50 の変異は、さまざまなクラス A GPCR を効果的に安定化することが示されています 8,32 が、我々の選択ではそのような変異は見つかりませんでした。 したがって、N3657.49K 変異がナトリウム部位の破壊と同様の構造効果および安定化効果を持つかどうかを見るのは興味深いでしょう。

まとめると、これらのデータは、哺乳動物細胞において、細菌の進化によって得られた最もよく発現する変異体と同等の、高度に安定化され、よく発現する受容体変異体がわずか 2 ラウンドの選択で得られることを示しています。 Gタンパク質の共役が不可能な細菌選択から得られた変異体と同様に、R1673.50L変異を保持する進化した受容体はGタンパク質シグナル伝達が著しく損なわれていた。 これは、進化した受容体が主に不活性な立体構造で安定化されたにもかかわらず、依然として高親和性アゴニスト結合を達成でき、これが生物物理学的特性の向上を説明していることを示唆しています。 しかし、哺乳動物細胞で進化した NTR1 変異体と大腸菌で進化した変異体 NTR1-TM86V および NTR1-L5X との間には、配列の類似性は明らかではありませんでした。 したがって、異なる構造変化を選択することによって、同様の生物物理学的特性を得ることができます。

GPCR は、細胞外側で多数の異なる刺激を感知するように進化しており、これは細胞外受容体領域の構造の大きな多様性に反映されています。 一部の GPCR には細胞外ドメイン (ECD) が含まれており、これらは多くの場合複雑なフォールディングを示し、適切なフォールディングと細胞表面への移動には哺乳類細胞の複雑な品質管理機構が必要です。 私たちのシステムでは、受容体の安定化と発現の最適化が微生物システムの結果と同等またはそれを超える程度に達成できることを実証したため、より複雑な構造を有する受容体も哺乳類システムでの選択に適しているかどうかに興味がありました。 この疑問に答えるために、GPCR のクラス B に属する副甲状腺ホルモン 1 受容体 (PTH1R) を選択しました。

このクラスの受容体は、ペプチドリガンドの結合に必要な追加の大きな細胞外ドメインによってクラス A GPCR とは構造的に異なります。 さらに、ECD のいくつかの翻訳後修飾により、受容体フォールドに顕著な構造的複雑さが加わり 11,33,34,35 、微生物での発現が妨げられます。 以前、我々は、全長受容体の結晶構造を解明するための前提条件である、改変された低分子ペプチドリガンドを用いて、より高い発現と安定性を得るために酵母におけるPTH1RのTMDを進化させることに成功した11。 しかし、天然の34アミノ酸ペプチドリガンドを使用して完全長PTH1Rを直接進化させる試みは、ミスフォールド受容体の毒性蓄積と、リガンドのサイズが大きいために、酵母細胞のリガンド結合部位に到達できないため失敗に終わった。細胞壁の透過性化は、微生物選択システムの限界を示しています。

哺乳動物系で PTH1R の進化を行うために、上記の NTR1 のライブラリーと同様の半合理的なアプローチに従って合成ライブラリーを作成しました。 ランダム化は PTH1R TMD に限定され、リガンド結合に影響を与える可能性のある ECD への変更を回避しました。 この研究は PTH1R 構造の決定前に行われたため 11、ライブラリーの設計はヒト グルカゴン受容体の構造相同モデルに基づいていました。 したがって、TMD 内の 118 個の位置がランダム化のために選択され、ここでアミノ酸置換基は化学的類似性に基づいて選択されました。 ただし、NTR1ライブラリとは対照的に、発現と安定性を超える受容体の特性も哺乳類細胞でも進化できるかどうかを調査することに興味があったため、受容体機能を破壊する固定変異は導入されませんでした（補足図4、補足注記を参照）。 。 それにもかかわらず、選択結果を追跡できるようにするために、ライブラリにいくつかの変更が追加されました。 酵母進化キャンペーンで同定された 19 個の位置を含めましたが、そのうち 7 個の特定の変異により、受容体は不活性で熱安定性の高い立体構造に保たれていました 11。 NTR1 ライブラリーの固定された R1673.50L 変異とは対照的に、酵母由来の各位置は完全にランダム化されているため、進化中にそのような位置で野生型または代替残基を選択することができます。 さらに、ECL（細胞外ループ）2と膜貫通ヘリックス311の上部との間にジスルフィド結合を形成するC351をランダム化して、構造的に関連する残基の破壊が選択を破壊するかどうかをテストしました（補足図4C）。

得られた cDNA ライブラリには、ランダム化された各位置に平均 5.6% の変異が含まれており、遺伝子ごとに約 7 個の変異が生じました (補足図 4E–F)。 この合成ライブラリーから、1.1 × 108 の多様性をもたらすウイルス ライブラリーを生成し、A-431 細胞を MOI 1 でライブラリーに感染させました。その後の選択には、2 つの蛍光標識ペプチド リガンドを使用しました。 1 つは、天然ペプチドの完全なアゴニスト効力を保持しながら、PTH1R の TMD にのみ結合するように操作された短いペプチド M-PTH(1-14) であり 36、2 つ目は、次の PTH アナログ PTH'(1-34) です。高親和性結合には受容体の ECD と TMD の両方との相互作用が必要なため、天然のペプチドアゴニストです 11,37,38。 蛍光標識されたリガンドのそれぞれを使用して合計 3 回の選択ラウンドが実行され、上位 0.2 ～ 0.5% の蛍光細胞が選別されました (補足図 4G)。 ここでも、選択ラウンドの増加に伴い、より高い細胞蛍光が観察されましたが、高蛍光細胞の少数の集団しか維持できませんでした（図3a）。 最終ラウンドの後、選択した各リガンドの 92 クローンの発現をスクリーニングし、両方のプールの 43 個の変異体を発現する上位のクローンをさらに分析しました。 進化した NTR1 バリアントと同様に、すべての PTH1R バリアントで、野生型よりも程度は低いものの（PTH1R では最大 9 倍、NTR1 では最大 85 倍）発現の増加が観察されました（図 3b、補足）表3)。 ただし、すべての PTH1R 変異体はシグナル伝達活性を維持しており、変異体の約 50% が野生型 PTH1R 活性化によって到達する最大 cAMP レベルを超えていました (図 3c、補足表 4)。 これは、安定性は高いがシグナル伝達不活性な変異体が得られた酵母における以前の PTH1R の進化とは対照的です 11。 進化したPTH1R変異体の配列分析により、かなり多様な変異セットが明らかになりました（補足図5）。 NTR1 とは対照的に、高度に保存された変異は見つからず、クラス B GPCR の保存されたモチーフも変化しませんでした。 しかし、保存された Val2PTH/PTHrP と相互作用する L3​​685.44、および活性状態 PTH1R38、39、40 の PTH ペプチドの N 末端残基と相互作用する M4256.57 および T4276.59 は、以下の部分で変異していることが判明しました。選択されたバリアントの 25%。 したがって、これらの変異は、観察された受容体効力の増加の機構的理論的根拠を提供する可能性があり、さらなる分析が必要である。

a PTH'(1–34)-HL647 (左パネル) または M-PTH(1–14)-HL647 (右パネル) による選択後の集団と野生型 PTH1R の比較: 並べ替え 1 (赤線)、並べ替え２（青線）、ソート３ａ（黒線）、ソート３ｂ（緑線、３ａの繰り返し）、ネガティブコントロール（濃い灰色の網掛け）。 b 飽和濃度のPTH'(1-34)-HL647を用いたフローサイトメトリー分析によって、生きたHEK293T細胞で評価された43の進化したPTH1Rバリアントの発現分析。 発現レベルは野生型受容体の発現と相対的であり、2〜3回の独立した実験の平均値±標準誤差として与えられます（補足表3）。 c 1 μM PTH(1-34) による刺激後の 43 個の進化した PTH1R バリアントの cAMP 蓄積。 データは、PTH1R と比較した最大 cAMP 濃度を表します。 棒は、二重に実行された3〜6の独立した実験の平均値±semを表します（補足表4）。 d PTH1Rと比較した43の進化したPTH1R変異体のリガンド親和性。 IC50 値は、M-PTH(1 ～ 14) または PTH(1 ～ 34) を用いた全細胞リガンド競合結合実験から得られました。 バーは、二重に実行された2〜8回の独立した実験からの、野生型受容体と比較した各変異体の計算された親和性（ΔpIC50）の平均変化±semを表します（補足表3）。 b – d 選択に使用したリガンドは棒プロットの下に示されています。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

酵母ライブラリーと同じ変異を現在のライブラリーでも許可したため、受容体の安定化に寄与すると同時に受容体シグナル伝達を妨害するこれらの変異が哺乳類系では選択解除され、ほとんどの細胞系では選択解除されることを観察するのは興味深いことでした。すべての位置で野生型バリアントが優先されました（補足図6）。 したがって、酵母細胞における不活性受容体の立体構造の安定化の成功に重要であった突然変異は、シグナル伝達能力のある環境では好まれなかった。 同様に、C351 の変異は完全に拒否され、ECL 2 とヘリックス 3 の間のジスルフィドの形成が選択時の重要な形質であることを示し (補足​​図 6)、これは受容体機能における既知の関連性と一致しています 33。 また、リガンド親和性に関しては、以前に進化した NTR1 変異体との明確な違いが観察されました。 PTH(1 ～ 34) の結合親和性は、PTH1R 変異体ではほとんど変化しないか、わずかに (0.6 ～ 5 倍) 増加しただけでした。 しかし、ほとんどの受容体変異体はM-PTH（1〜14）に対する親和性の大幅な増加を示し、PTH（1〜34）がECDへの結合に依存できるという両方のリガンドの結合における根本的な違いを示しています（図3d、図3d、補足表 3)。 しかし、どちらの選択計画からも変異体間の見かけの受容体特性に関する差異は検出されなかったため、これらの差異は選択中のリガンドの種類によって引き起こされたものではないと思われる。 まとめると、哺乳動物細胞では、サイズの異なる 2 つのリガンドのセットを備えた完全長 PTH1R を進化させることが可能でしたが、微生物系では発現宿主による制限により不可能でした。 さらに、シグナル伝達能力を維持した受容体変異体が得られ、選択結果に対する細胞状況の重要性が実証されました。

NTR1 の場合、結合ポケットから G タンパク質界面へのアロステリック伝達の共役が解除されると、アゴニスト親和性の蓄積が可能となり、その結果、受容体がアゴニスト結合性の不活性だが安定した立体構造に導かれる可能性があります。 進化した PTH1R には当てはまりませんでした。 単離膜画分中の5つの進化した受容体変異体の熱安定性を評価したところ、試験したすべての変異体は野生型PTH1Rと比較して熱安定性の低下を示しました（補足図7A、補足表5）。 進化した PTH1R 変異体のリガンド親和性の増加と組み合わせたシグナル伝達能力の保持と、G タンパク質を発現する哺乳動物細胞で指向性進化が行われたという事実を考慮すると、選択された変異がこの状況に合わせて受容体を最適化した可能性があると我々は推測しました。 この考えと一致して、ミニGの存在下では、ほとんどの変異体で熱安定性が増加し（補足図7B）、P34_05では減少が減少し、すべての変異体で相対的な改善が得られました（補足図7C）。 このことは、細胞全体のさまざまなリガンドの結合を比較するとさらに明らかになりました。 上記に示すように、両方のアゴニスト、M-PTH（1〜14）およびPTH（1〜34）の親和性は、野生型PTH1Rと比較した場合、PTH1R変異体に対して増加しました（図3d、4a）。 ただし、部分アゴニスト PTH(3 ～ 34) では、さらに逆アゴニスト IA-PTH(7 ～ 34) では、相対親和性の逆転が観察され、野生型 PTH1R の見かけの親和性は、野生型 PTH1R の方がわずかに高い見かけの親和性を示しました。進化した変異体（図4a）。 GPCR シグナル伝達の三元複合体モデルによれば、G タンパク質の結合により受容体の立体構造平衡が活性状態に移行し、アロステリックにアゴニスト親和性が増加し、次にアンタゴニスト親和性が減少します 41、42、43。 したがって、進化したPTH1R変異体には、Gタンパク質の結合に有利な立体構造を安定化させる変異が組み込まれており、その結果、Gタンパク質の存在下で受容体の平衡がアゴニストに対する高親和性状態に移行しているのではないかと我々は推測した。

a 進化した PTH1R 変異体は、高親和性アゴニスト結合を示しますが、細胞内の部分アゴニストまたは逆アゴニストに対する親和性は同等か低下しています。 全体で測定された完全 [M-PTH(1-14) および PTH(1-34)]、部分 [PTH(3-34)]、および逆アゴニスト [IA-PTH(7-34)] の競合リガンド結合曲線野生型 PTH1R または 5 つの進化した変異体を発現する細胞。 b 進化した PTH1R 変異体の高いアゴニスト親和性は、G タンパク質結合状態の野生型 PTH1R のアゴニスト親和性と類似しています。 進化した PTH1R に対する M-PTH(1-14) のリガンド結合曲線は、PTH1R 野生型または 5 つの進化した変異体を発現する細胞から得られた膜画分で、12.5 μM の非存在下 (左パネル) または存在下 (中央パネル) で測定されました。ミニG。 M-PTH(1-14) と標識 M-PTH(1-14) の結合の競合によって得られた相対結合定数。12.5 μM mini-G の非存在下または存在下で細胞全体 (a) と膜画分で測定。 (右パネル)。 したがって、正の値は、細胞よりも膜画分の結合が強いことを反映します。 c アゴニスト親和性の増加は G タンパク質に依存します。 40 nM M-PTH(1-14) の結合を、漸増濃度の mini-G を補充した膜画分で測定しました。 データは、ミニ G の非存在下での PTH1R の結合レベルに関連しています (灰色の領域)。 左パネル：リガンド結合の基礎的増加およびGタンパク質依存性増加を示す変異体。 EC50 値は縦の点線で示されます (PTH1R: 1.39 ± 0.2 μM、P34_05: 0.28 ± 0.06 μM、P34_13: 0.38 ± 0.1 μM)。 右パネル: G タンパク質とは無関係にリガンド結合の増加を示す変異体。 d G タンパク質非依存性のリガンド結合の増加は、より高い基礎活性によるものです。 PTH1R変異体を発現する細胞にホスホジエステラーゼ阻害剤IBMXを添加してから30分後にcAMPレベルを測定し、受容体発現レベルに対して正規化した。 データは、二重に実施した３回の実験の平均値±標準誤差を表す。 **p = 0.0044、****p < 0.0001。 統計的有意性は、一元配置分散分析およびボンフェローニ多重比較によって決定されました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

この仮説を検証するために、リガンド結合に対する G タンパク質の効果を直接比較しました。 単離された膜画分における野生型 PTH1R に対する M-PTH(1-14) の親和性は、細胞全体における親和性と比較して 5 倍増加しました。これは、ヌクレオチド濃度が低いため、より安定した受容体 G タンパク質複合体の形成を反映していると考えられます。膜画分中42。 対照的に、進化した変異体のアゴニスト親和性は、細胞全体での親和性と同一のままでした。 変異体 P34_13 についてのみ、細胞から膜への移行による野生型 PTH1R レベルへの親和性の低下が観察されました。 G タンパク質の活性化状態を模倣するミニ G を膜画分に添加することにより 44、野生型 PTH1R の親和性は進化した変異体の親和性へとさらにシフトし、進化した変異体の高親和性状態が確かに次のようなものによるものであることを示唆しています。活性状態の立体配座をとる傾向がより高くなります（図4b）。

これらの発見を裏付けるために、各変異体に対する高親和性状態を誘導する G タンパク質の影響をさらに評価しました。 この目的のために、最大下濃度での M-PTH(1-14) による受容体占有を、G タンパク質濃度の増加の関数として測定しました (図 4c)。 外部から添加された G タンパク質の非存在下ですでに進化したすべての受容体変異体では、野生型 PTH1R と比較した場合、より大きな割合の受容体がリガンド結合しており、競合結合曲線で観察された見かけの高親和性状態を反映しています。 予想どおり、G タンパク質濃度の増加に伴い、野生型 PTH1R への M-PTH(1-14) の結合割合は最大 2 倍にシフトし、G タンパク質によって誘導される受容体の高親和性状態への移行を示しました。バインディング。 変異体 P34_05 および P34_13 は、両方の変異体が添加 G タンパク質濃度の増加に伴って高親和性状態に移行したため、同様の挙動を示しました。 ただし、4 ～ 5 倍低い EC50 値は、両方の受容体変異体が G タンパク質に対してより高い親和性を示し、したがって高親和性状態に容易に到達することを示唆しています。 対照的に、変異体 P34_06、P34_07、および P14_12 は、添加された G タンパク質とは無関係に、すでに高親和性状態にありました。 同様に、後者の変異体は基礎受容体活性の増加を示しましたが、変異体P34_05およびP34_13の基礎活性は野生型PTH1Rの基礎活性と同様でした（図4d）。 したがって、シグナル伝達が可能な環境におけるアゴニストによるPTH1Rの進化は、受容体の活性型Gタンパク質結合状態への移行を促進する、またはアゴニスト結合と適合する立体構造にある基底受容体シグナル伝達を促進する変異の蓄積をもたらした。どちらもアゴニストに対する見かけの親和性が高くなります。

細菌および酵母の選択システムは、各細胞が単一の受容体変異体を保有する大規模なライブラリーを作成できるため、GPCR の定方向進化に使用されてきました。 高い形質転換効率とかなり均一なプラスミドコピー数の確立により、遺伝子型と表現型の間のつながりが保存されており、両方を容易に決定できることが確認されます。 しかし、微生物系の適用可能性は、細胞壁または外膜の外側障壁のため、選択に使用できる比較的小さなリガンドに限定されます。 さらに、選択プロセスの開始時にネイティブ受容体の発現を最小限に抑える必要があるため、一部の受容体の毒性が問題となる可能性があります。

ここでは、そのような制限がないシステムの開発を示します。 哺乳動物細胞は、輸出時の品質管理、膜組成、翻訳後修飾機構など、GPCR にとってネイティブな細胞環境を提供し、複雑な受容体であっても最適な発現条件をもたらします。 同時に、細胞表面のリガンド結合ポケットには、あらゆるサイズおよび組成のリガンドが容易にアクセスできます。 抗体フラグメントなどの細胞外表面に結合する構造特異的モジュレーターでさえ、選択ツールとして使用できる可能性があります。 さらに、哺乳動物細胞では、GPCR は内因性の細胞シグナル伝達フレームワークに組み込まれています。 これにより、シグナル伝達経路をさらに調査し、特定のシグナル伝達特性に向けて選択を指示する可能性が提供されます。

しかし、哺乳動物細胞でクローンライブラリーを作成することは困難です。 標準的なトランスフェクション法は比較的効率が悪く、通常は数百個のプラスミド（細胞間でかなりの広がりを持っている）が各細胞に取り込まれ、遺伝子型と表現型の結合がどうしても妨げられるため、適切ではありません。 私たちの開発の鍵は、ワクシニアベクター 24 に基づいた高効率ウイルス形質導入システムを活用することでした。 これは、形質導入率を細胞あたり平均 1 粒子に調整する可能性を組み合わせ、モノクローナル性を維持し、さらに均一なコピー数に達する固有のベクター増幅と組み合わせます。 もう 1 つの特徴は、GPCR などの大きなタンパク質にも適合する非常に多様なライブラリーの作成を可能にするウイルスベクター内の独自の組換えモジュールです。

一般にランダム突然変異誘発が遺伝的多様性を生成するために使用されていますが、我々はその代わりにコドンベースの固相合成によって合成 GPCR ライブラリーを作成しました 45,46。これにより、ランダム化の位置と組成を完全に制御できるほか、フレームシフトや終止コドンも回避できます。 したがって、事前の構造的および機能的知識を設計に組み込んで、選択結果を改善し、望ましくない選択事象をアプリオリに排除し、例えばアミノ酸タイプまたは野生型コドンの割合について、ライブラリーに所定のバイアスを導入することができる。 さらに、ここではこのアプローチを使用して、予測可能な効果を持つ特定の変異をライブラリにスパイクすることにより、選択システムの忠実性をテストしました。 NTR1 の場合、結晶構造 10 はランダム化に適した残基を同定するためのテンプレートとして機能し、変異誘発をすべてのクラス A GPCR の最も一般的な対応するアミノ酸に限定することで、進化の状況を維持し、潜在的に有害な変異を排除しました。 PTH1R については、当時 PTH1R の構造情報も十分な系統発生データも利用できなかったため、構造相同性モデルと化学的保存的突然変異誘発に基づいてライブラリを設計しました。 これは、正確な構造情報が存在しない場合でも、強力なライブラリーを生成できることを示しています。 将来的には、ワークフローに容易に組み込むことができる GPCR に関する構造的および機能的情報の量が着実に増加していることから、さらに洗練されたライブラリー設計が導き出される可能性があります。

我々の最初の目標は、この哺乳類システムの忠実性を以前のアプローチと比較するために、微生物の選択、つまりGタンパク質などの下流エフェクターの非存在下での受容体の進化を再現することでした。 したがって、NTR1 のライブラリーは、G タンパク質のカップリングに必要な受容体コアの DRY モチーフを破壊する R1673.50L 変異を含むように設計されました 14、27、28、29。 注目すべきことに、R1673.50L変異自体は安定性に影響を及ぼさず、野生型NTR1と比較して発現レベルにわずかな影響しか与えなかったが、Gタンパク質からの受容体の脱共役を可能にし、それが増殖中に変異の蓄積を引き起こした。発現レベルと熱安定性を同時に強力に増加させる選択 (図 5)。 いくつかの変異体は、大腸菌内で広範な発現誘導進化を経た受容体の発現レベルを超えていました26。 また、微生物系における以前の選択と一致して、すべての進化した変異体は、G タンパク質を活性化できないにもかかわらず、アゴニスト親和性の増加を示しました。 重要なのは、この事実は、望ましい特徴、より高い機能発現、およびタンパク質の安定性の選択を妨げるものではありません。 以前に安定化された受容体の構造で観察されたように 10,14、これは、シグナル伝達経路の共役解除が選択結果に 2 つの影響を及ぼしたことを示唆している可能性があります。1 つは、アゴニストの結合に応じて受容体の細胞外部分を強化する変異が豊富であったことです。高親和性アゴニスト結合を促進し、再び受容体の安定性に貢献します。 第二に、受容体の細胞内部分は、R1673.50Lの存在によって促進される、受容体を不活性な立体構造に保つ突然変異によって安定化された(図5)。 要するに、受容体の 2 つの部分は独立して進化したと見なすことができます。

GPCR は、リガンドと G タンパク質の結合によってアロステリックに調節される多数の立体構造状態をサンプリングします。 脱共役変異 (赤い星) を導入すると、リガンド結合ポケットから G タンパク質界面へのシグナル伝達が中断されます (左の経路)。 したがって、G タンパク質の非存在下でのその後の指向性進化では、またはすでに不活性状態を安定化させている変異によってその結合が妨げられている場合、受容体を不活性状態 (灰色) でさらに安定化させる変異が優先的に選択され、堅固で安定したタンパク質が得られます。形態。 受容体の機能が選択の開始時に保持されている場合、G タンパク質を含む細胞環境が選択の結果を決定します。 リガンド結合ポケットのアゴニスト占有立体構造とGタンパク質結合界面（青色）の活性状態（AS）立体構造との間のアロステリックカップリングを促進する変異が選択された。 場合によっては、活性状態の立体構造の強力なアロステリック結合を促進する変異が豊富にあり、その結果、構成的な受容体活性が得られました (緑色)。 図は Nygaard et al.60 に従って修正されました。

対照的に、PTH1R ライブラリには、下流のシグナル伝達を妨害すると予想される固定変異は含まれていませんでした。 結果として、内在性 G タンパク質は原則として受容体と相互作用し、選択結果に影響を与えることができました。 実際、ライブラリーに意図的に含まれ、シグナル伝達能力の低下を犠牲にして受容体を安定化させる変異は、これらの選択条件下では検出されませんでした。 その発見と一致して、選択された受容体変異体は、Gタンパク質を欠く膜調製物において野生型PTH1Rと比較してさらに低い熱安定性を示し、根本的に異なる選択経路がたどられたことを示唆している。 G タンパク質を膜に添加するとすぐに、期待された安定性の向上が見られました。

NTR1 と同様に、選択に使用されたペプチド アゴニストとは無関係に、ほとんどの変異体で受容体発現とリガンド親和性の一般的な増加が観察されました。 リガンド親和性の増加は、ネイティブ PTH(1 ～ 34) よりも M-PTH(1 ～ 14) の方が顕著でした。 突然変異が TMD に限定されており、M-PTH(1-14) が ECD と追加的に接触しないことを考慮すると、TMD 内の変化がリガンド親和性の増加の原因であると仮定するのが合理的でした。 PTH(1-34) 親和性のそれほど顕著な違いは、クラス B GPCR の ECD と結合するペプチドの C 末端部分の相互作用によって提供される追加のエネルギーによって説明できます 47。

興味深いことに、進化した PTH1R 変異体に対するアゴニスト親和性の明らかな増加は、全細胞で最も顕著でした。 アゴニストが GPCR に結合すると、その立体構造平衡が G タンパク質との相互作用に有利な状態に移行し 48,49、ヌクレオチド結合ポケットの不安定化と GDP 解離による G タンパク質の活性化につながります 50。 得られるヌクレオチドを含まない三元複合体は、多くの場合、アゴニスト結合親和性の増加を示します 41 が、細胞内 GTP 濃度が高いため、生体内ではその寿命が極めて短く、GTP が Gα51 に急速に結合します。 全細胞と比較してヌクレオチドが枯渇した膜画分では、野生型 PTHR のアゴニスト親和性の相対的な増加が観察され、ヌクレオチドの非存在下での三元複合体のより高い安定性を反映しています。 これは、ヌクレオチドのない Gα 状態を模倣して、ミニ G を膜画分に補充するとさらに顕著でした。 これらの条件下で、野生型受容体は、進化した変異体のそれに匹敵するアゴニスト親和性を示した。

したがって、PTH1R の選択中に、活性状態の G タンパク質立体構造の助けがなくても受容体が高親和性状態に移行できるようにする変異が獲得されました。 したがって、リガンド結合部位と G タンパク質結合部位の不活性構造ではなく活性型立体構造とのアロステリック結合は、選択された変異によって強化され、選択された変異体の多くでアゴニストと G タンパク質の親和性が同時に高まります 31 (図 5)。 ）。 この発見と一致して、ミニ G に対する見かけの親和性は、進化した変異体のうち 2 つで増加しました。 特に、3 つの変異体では、受容体のアゴニスト占有に対するミニ G の追加の影響は観察できませんでした。 興味深いことに、これら 3 つの変異体は構成的な受容体活性の増加を示し、これが受容体の高親和性状態が G タンパク質の添加によってさらに変化しない理由を説明しています。

本研究では、正しく折り畳まれて組み込まれた受容体の発現の代用として、また一次選択圧としてリガンド結合を使用しました。 これにより、NTR1 については発現と安定性が最適化された受容体変異体が得られましたが、NTR1 と同様に測定した場合、PTH1R には当てはまりませんでした。 PTH1R は完全に機能するシグナル伝達環境で進化することができ、その選択が受容体の機能によって強い影響を受けることが観察されました。 G タンパク質の結合に直接選択圧力を加えなくても、より高い安定性を達成する受容体変異体が得られましたが、それは G タンパク質との結合を許可した場合に限られます。 しかし、NTR1 選択の場合とは異なり、PTH1R 選択では、高い蛍光レベルの細胞のプールを維持することがより困難でした。 高コピーのウイルスベクターを使用した FACS 選択のストレス下では、一部の高発現クローンが失われる一方で、他のクローンは互換性があるという可能性を排除することはできません。 さらに、高い構成活性を示す変異体は、絶え間ない内部移行によって受容体が蛍光リガンドにアクセスできなくなり、また高い基礎シグナル伝達により細胞生存率が損なわれる可能性があるため、選択の過程で失われた可能性があります。

まとめると、この哺乳類の選択システムにより、この受容体クラスのシグナル伝達のメカニズムを研究するための貴重なツールとなる、大きく変化した機能特性を示す受容体を選択することができました。 安定化された受容体は、初期の効力が低いため機能アッセイが不可能であり、ヒットファインディングは、可溶化受容体に対するNMRやSPR16などの結合アッセイに依存する必要があるフラグメントベースの創薬に役立ちます。 高い構成的活性を有する変異体は、薬物スクリーニングアプローチの特に興味深い候補となる可能性がある52。 上で述べたように、現在の設定ではこれらの変異体の一部が見逃される可能性がありますが、下流のシグナル伝達を直接測定する他の選択パラメーターを使用することが解決策の可能性があります。 近年、哺乳動物細胞のシグナル伝達カスケードのあらゆるレベルでの GPCR 機能を研究するために、多数のセンサー システムが利用できるようになりました。 これらのアッセイの多くは蛍光ベースであり、原理的にはフローサイトメトリーのアプリケーションと互換性があります。 このようなアッセイには、受容体-Gタンパク質、受容体-アレスチン、さらにはスプリットフルオロフォアシステムまたはFRETセンサーに基づくGタンパク質相互作用アッセイが含まれます53、54、55、56、57。 受容体選択のためのこのようなセンサーの統合は、受容体の進化を特定の機能特性に向けることができるため、哺乳動物の進化システムの多用途性をさらに高めるでしょう。 この戦略は、シグナル伝達バイアスのメカニズムと GPCR 媒介シグナル伝達の調節メカニズムを解読するのに特に有用であることが証明されるはずです。 さらに、膜受容体を薬物スクリーニング用途のバイオセンサーとして再利用することも可能となり、光遺伝学的用途のためのツールの作成に使用できる可能性があります。

ヒト PTH(1 ～ 34) および PTH(3 ～ 34) は Bachem から入手しました。 ニューロテンシン 8–13 [NT(8–13)] は Anaspec からのものでした。 ヒト [Ac5c1、Aib3、Q10、Har11、A12、W14]PTH(1-14)、[M-PTH(1-14)] は、ペプチド スペシャルティ ラボラトリーズによって合成されました。 M-PTH(1-14) は HiLyte 色素 647 [M-PTH(1-14)-HL647] で K13 で標識されました。 [Nle8,18,Y34,C35]PTH(1-34) は、C35 で HiLyte 色素 647 [PTH'(1-34)-HL647、PTH(1-34) と比較した配列の変化を示すプライム] で標識されました。 ニューロテンシン 8-13 は、N 末端アミノ基が HiLyte-647 [HL647-NT(8-13)] または HiLyte-488 [HL488-NT(8-13)] で蛍光標識されています。 すべての蛍光標識ペプチドは Anaspec によってカスタム合成されました。

HEK293T 細胞 (カタログ番号 CRL-11268)、A-431 (カタログ番号 CRL-1555)、および BS-C-1 細胞 (カタログ番号 CCL-26) は ATCC から入手し、ダルベッコ改変培地で培養しました。 10% (v/v) のウシ胎児血清を添加しました。 細胞は、5% CO2、95% 空気の加湿雰囲気中で 37 °C に維持されました。 HEK293T 細胞の一過性トランスフェクションは、製造業者のプロトコールに従って TransIT-293 (Mirus) 試薬を使用して実行されました。 CHO-S 細胞（Life Technologies、カタログ番号 R80007）は、8 mM L-グルタミン、0.1 mM ヒポキサンチンおよび 0.1 mM チミジンを補充した Power CHO 2CD 培地（Lonza）を使用して振盪懸濁培養として維持しました。 トランスフェクション前の接着を促進するために、細胞を10%ウシ胎児血清を含むDMEMに一晩播種しました。 メーカーのプロトコールに従って、リポフェクタミン試薬(Invitrogen)を用いて一過性トランスフェクションを実施した。

ラット NTR1 およびヒト PTH1R の cDNA ライブラリーは、Slonomics® テクノロジーを使用して線状 DNA フラグメントとして MorphoSys AG によってカスタム合成されました 26、45、46。 配列の定常部分は、野生型を含むプラスミドから増幅されました。 可変部分を生成するために、可変領域内の 2 つの隣接する位置のすべての組み合わせを表すアンカー分子の混合物が定義された比率で生成されました 26、45、46。 これらの混合物はライゲーションによって成長する DNA 鎖に接続されました。 反応生成物を、ストレプトアビジンでコーティングされた表面（Microcoat）上に固定化することによって精製した。 次に、次の反応サイクルのための新しいオーバーハングを酵素 Eam1104I (Thermo Scientific) による制限によって生成し、アンカー分子の新しい混合物を追加しました。 3 ～ 7 回の反応サイクルの後、生成物のペアが結合して転位中間体が生成されました。 これらは、第 2 ラウンドで結合されて長い可変領域を形成するか、または制限およびライゲーションによって定常部分と組み立てられます。 長さのバリアントを個別に合成し、PAGE で定量化し、規定の比率で混合し、1 つのプールとして組み立てました。 ＰＴＨ１Ｒライブラリーを２つの等しいサイズの断片に分けて合成し、隣接領域におけるＥｓｐ３Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による制限とその後のライゲーションによって結合した。 最終的なライゲーション産物は、Phusion DNA ポリメラーゼ (NEB) を使用した PCR によって約 2 μg まで増幅されました。

ハツカネズミ IgG シグナル配列 aa 1 ～ 17 を持つクローニング カセットを含むラット NTR1 のアクセプター コンストラクトは、哺乳類発現プラスミド (EFMOD、Vaccinex、5' BssHII および 3' SalI クローニング サイト) とワクシニア トランスファー プラスミド ( VHEH5、Vaccex、5' BssHII および 3' BsiWI クローニング サイト)。 野生型ラット NTR1 遺伝子 (アミノ酸 43 ～ 424) と NTR1 バリアント、L5X および TM86V を、PCR (iProof 高忠実度 DNA ポリメラーゼ、BioRad) および次のプライマーを使用して増幅しました: NTRBSSHIIsense 5'-tttttGCGCGCACTCCACCTCGGAATCCGACACGG-3標準プロトコルによる ' および NTRaddSal1 5'-ttttGTCGACTCAGTACAGGGTCTCCCGGGTG-3' (EFMOD の場合) または NTRAddBsiW1stop-5'-tttttCGTACGtTCAGTACAGGTCTC- 3' (VHEH5 の場合)。 続いて、PCR 産物を発現プラスミドおよびトランスファープラスミドにクローン化しました。 同じプライマーを使用して、変異体ライブラリー2218_-1_LIB_rNTR1 (43-424)のPCR(Advantage2ポリメラーゼ、Clontech)によってDNAライブラリーの構築を行った。 PCR産物は1%アガロース/TBEゲル上で分離されました。 １１７７ｂｐのバンドをゲル精製し（Ｑｉａｑｕｉｃｋ、Ｑｉａｇｅｎ）、消化し、ＮｘＧｅｎＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用してＶＨＥＨ５プラスミドに連結した。 NEB10Beta 大腸菌細胞 (BioRad GenePulser、1 mm キュベット、2.0 kV、200 Ω、25 μF) のエレクトロポレーションによって高効率形質転換を行い、~1.4 × 107 の多様性を持つプラスミド ライブラリを作成しました。

PTH1R シグナル配列 aa 1 ～ 23 (天然に存在する BsiWI 部位を含む) および 3' SalI 部位を含むクローニング カセットを備えたヒト PTH1R のアクセプター構築物は、哺乳類発現 (EFMOD、Vaccinex) と誘導性ワクシニア転移プラスミド ( T7terVHE、ワクチンネックス）。 全長野生型ヒト PTH1R 遺伝子 (1 ～ 593) を PCR (Q5 DNA ポリメラーゼ、NEB) を使用して増幅し、発現プラスミドおよび転移プラスミド (BsiWI/Sall) にクローニングしました。 DNA ライブラリーの構築は、以下のプライマー: PTH1Rsignalsense 5-CTCAGCTCCGCGTACGCGCTGGTG-3' および PTH1R AS 5'-TGTCCGTTCGGTCGACTCACATGACTGTCTCC-3' を使用して、標準条件および最小限のサイクリングで変異体ライブラリー SLN2248 の直鎖状 DNA の PCR (Q5 DNA ポリメラーゼ、NEB) によって実行されました。 。 PCR産物は1%アガロース/TBEゲル上で分離されました。 １７３４ｂｐのバンドをゲル精製し（Ｑｉａｑｕｉｃｋ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＢｓｉＷＩ／ＳａｌＩで消化し、ＮｘＧｅｎＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用してＴ７ＴｅｒＶＨＥプラスミドに連結した。 約 6.3 × 106 の多様性を持つプラスミド ライブラリを作成するための高効率形質転換については上記で説明しました。

ワクシニアベクター V7.5 ウイルス (Vaccinex) をプロテイナーゼ K (Thermo Fisher) で消化し、DNA をフェノール/クロロホルム抽出によって精製しました。 V7.5 ウイルス DNA を制限エンドヌクレアーゼ ApaI (NEB) および NotI (NEB) で消化し、Amicon 超遠心カラム (Millipore Sigma) で精製しました。 BSC-1 細胞を、細胞あたり 1.5 プラーク形成単位 (pfu) の感染多重度 (MOI) でヘルパー鶏痘ウイルスに感染させ、消化された V7.5 ベクター DNA、各受容体ライブラリー、および対応するコントロール プラスミドをトランスフェクトしました。 感染/トランスフェクトされた細胞を5日間インキュベートし、細胞を凍結融解することによってワクシニアウイルスを回収しました。 対照クローンの個々のプラークを選択し、増幅しました。 ウイルス DNA は PCR によって精製および増幅されました。 陽性クローンは配列決定によって確認された。 ライブラリーのウイルスストックはプラークアッセイによって力価測定されました。 個々のクローンをランダムに選択し、PCR によって組換え効率をチェックしました。 得られたワクシニアライブラリーは、95% を超える正の組換え効率を示し、NTR1 および PTH1R に対してそれぞれ約 1.3 × 108 個および約 1.1 × 108 個の固有の組換え体を保持していました。

A-431 細胞を感染の前日に DMEM + 10% (v/v) FBS に播種し、37 °C、5% CO2 で一晩増殖させました。 次いで、細胞を、ＮＴＲ１対照またはライブラリーを発現するウイルスを細胞あたり１ｐｆｕのＭＯＩで一晩感染させた。 適切な pfu のウイルスを細胞単層をカバーする最小培地量に希釈し、37 °C、5% CO2 で 1 ～ 2 時間インキュベートしました。 次に、細胞を十分な培地で覆い、16 ～ 18 時間インキュベートしました。 細胞を Accutase™ を使用して収集し、ペレット化し、FACS バッファー [PBS、1% (w/v) BSA] または Tris バッファー [20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、118 mM NaCl、5.6 mM グルコース、1.2 mM KH2PO4] で洗浄しました。 、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ］。 細胞を FACS バッファーまたは Tris バッファーに 2 × 106 細胞/ml で再懸濁し、蛍光リガンドとともに氷上で 1 ～ 2 時間インキュベートしました。 特異性を確認するために、重複した細胞サンプルを 100 倍過剰の未標識リガンドとともにインキュベートしました。 次に細胞を適切な緩衝液で洗浄し、フローサイトメーターで分析する前に生細胞と死細胞を区別するためにヨウ化プロピジウムを含む0.5%パラホルムアルデヒドで固定しました。 ゲート戦略は補足図8に例示されています。

NTR1 クローンのライブラリーに感染した A-431 細胞を、40 nM NT(8-13)-HL647 を使用して複数回繰り返して選別しました。 ソーティングの最初のラウンドでは、上記のように、4 × 107 A-431 細胞を MOI 1 で 37 °C、5% CO2 で一晩 NTR1 ライブラリーに感染させました。 翌日、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を使用して収集し、総量１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中の４０ｎＭのリガンドで氷上で１時間、時折穏やかに旋回させながら染色した。 次に細胞を FACS バッファーで 2 回洗浄し、1 ml あたり 2 × 107 細胞で再懸濁し、40 μm フィルターに通した後、BD FACS Aria ソーターで選別しました。 上位 0.3% の蛍光細胞 (合計 6800) を収集し、複数回の凍結/解凍サイクルによって溶解し、複数の BSC-1 細胞フラスコ内でウイルスを 2 ～ 3 日間増幅しました。

増幅されたウイルスは、2 回目の選別のために A-431 細胞に再度感染するために使用される前に収集され、力価測定されました。 最初のソートのプールの多様性はわずか 6800 個であったため、2 番目のソートでは 3 × 106 A-431 細胞を感染させました。 上位 0.06% のイベントが収集され、上記のように増幅されました。 ソートの濃縮は、全体を通して小規模な感染とリガンド染色によってテストされました。

PTH1R クローンのライブラリーに感染した A-431 細胞を、120 nM M-PTH(1-14)-HL647 または 120 nM PTH'(1-34)-HL647 を使用して複数回繰り返して選別しました。 ソーティングの最初のラウンドでは、上記のように、1.2 × 108 A-431 細胞に PTH1R T7 誘導性ライブラリーと弱毒化 T7 プロモーター ウイルスを MOI 1 で 37 °C、5% CO2 で一晩感染させました。 翌日、細胞をAccutase(商標)を使用して回収し、総量6ml中の120nMのリガンドで氷上で1時間、時折穏やかに旋回させながら染色した。 次に細胞を FACS バッファーで 2 回洗浄し、1 ml あたり 2 × 106 細胞で再懸濁し、40 μm フィルターに通した後、BD FACS Aria ソーターで選別しました。 上位 0.5% の蛍光細胞を収集し、複数回の凍結融解サイクルによって溶解し、複数の BSC-1 細胞フラスコ内でウイルスを 2 ～ 3 日間増幅しました。

増幅されたウイルスは、2 回目の選別のために A-431 細胞に再度感染するために使用される前に収集され、力価測定されました。 以降のソーティングの各ラウンドは 1.5 × 107 A-431 細胞を使用して実行され、ゲートの厳密性はラウンドごとに増加しました。 ソートエンリッチメントは、全体を通して小規模な感染とリガンド染色としてテストされました。

ワクシニアDNAを選別したプールから抽出した(DNA Blood mini、Qiagen)。 プール変異体は、ＰＣＲ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、最小限のサイクルで標準プロトコールによりプールＤＮＡから増幅された。 NTR1 の場合、プライマー NTRBSSHIIsense 5'-tttttGCGCGCACTCCACCTCGGAATCCGACACGG-3' および NTRaddSal1 5'-ttttGTCGACTCAGTACAGGGTCTCCCGGGTG-3' (EFMOD)、PTHR1 の場合、シグナルセンス 5'-CTCAGCTCCGCGTACGCGCTGGTG-3' および PTHR1AS 5'-CCCCCCTCGAGGTCGACTCA CATGACTGTCTCCC-3'。 続いて、PCR 産物を哺乳類発現ベクター EFMOD にクローン化しました。 92〜94個のコロニーを選択し、プラスミドDNAを単離することによってミニライブラリーを調製しました（Qiaprep 96turbo、Qiagen）。 DNA 配列は、完全にカバーするために 2 ～ 3 個のプライマーを使用したサンガー シークエンシングによって分析されました。

Mini-Gs 393 は基本的に前述のように調製されました 44。 簡単に説明すると、ミニ G は 20 °C で大腸菌株 BL21(DE3) で発現されました。 誘導の 16 ～ 20 時間後に遠心分離によって細胞を回収し、溶解バッファー [40 mM HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、5 mM イミダゾール、10% (v/v) グリセロール、5 mM MgCl2、50 μM GDP] に再懸濁しました。 、１ｍＭ ＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅＩ、５０μｇ／ｍｌリゾチーム］を加え、ＨＰＬ６細胞溶解装置（Ｍａｘｉｍａｔｏｒ ＧｍｂＨ）中で１７００バールで破壊した。 ライセートを遠心分離（20,000 gで45分間）によって清澄化し、上清をNi-NTAカラム（Thermo Fisher Scientific）にロードしました。 カラムを 10 CV 洗浄緩衝液 [20 mM HEPES (pH 7.5)、500 mM NaCl、28 mM イミダゾール、10% (v/v) グリセロール、1 mM MgCl2、50 μM GDP、1 mM DTT] および結合タンパク質で洗浄しました。 ２ＣＶの溶出緩衝液［２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ ＧＤＰ、０．５ｍＭ ＤＴＴ］中で段階的に溶出した。 イミダゾールを PD-10 脱塩カラム (Cytiva) で除去し、タンパク質を 25 mg/ml に濃縮し、凍結緩衝液 [25 mM HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、15% (v/v) グリセロール、 5 mM MgCl2、10 μM GDP、0.25 mM DTT]。

受容体変異体を HEK293T 細胞に一時的にトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 48 時間後、細胞を Accutase™ で剥がし、0.2% BSA を添加した PBS 中の 20 nM HL488-NT(8-13) または 100 nM PTH'(1-34)-HL647 とともに氷上で 2 ～ 4 時間インキュベートしました。 。 非特異的結合は、100 倍過剰の未標識ペプチドの存在下で測定されました。 次いで、細胞を氷冷したＰＢＳで３回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で蛍光強度を測定した。

リガンド結合実験は、細胞全体、または一時的にトランスフェクトされた HEK293T 細胞から得られた細胞膜に対して行われ、どちらの場合も前述の HTRF 結合アッセイを使用しました 11,14。 すべての受容体変異体を、N 末端 SNAP タグ (Cisbio) を含む哺乳類発現ベクターにサブクローニングしました。 NTR1 構築物の場合、SNAP タグは受容体の残基 43 に融合されました。 PTH1R の場合、SNAP タグは残基 29 または残基 171 のいずれかに融合され、したがって ECD が除去されました。 HEK293T 細胞に受容体構築物を一時的にトランスフェクトし、全細胞結合アッセイの場合はポリ-L-リジンでコーティングした 384 ウェル プレート (Greiner) にウェルあたり 20,000 細胞で播種するか、膜の場合は 10 cm ペトリ皿に 5 × 106 細胞で播種しました。準備。 トランスフェクションの48時間後、細胞をリガンド結合緩衝液[20 mM HEPES pH 7.5、100 mM NaCl、3 mM MgCl2および0.02% (w/v) BSA]中で50 nM SNAP-Lumi4-Tb (Cisbio)とともに2時間インキュベートしました。 37℃で。 細胞をアッセイ緩​​衝液で４回洗浄し、全細胞リガンド結合実験に直接使用するか、または粗細胞膜抽出物を前述のように調製した。 次に、蛍光標識されたトレーサーペプチドと一定範囲の濃度の未標識競合ペプチドを含む細胞またはウェルあたり 0.2 ～ 1 µg の膜を氷上で 4 時間インキュベートし、リガンド結合を測定しました。 NTR1 の場合、2 nM の HL488-NT(8-13) をトレーサー ペプチドとして使用しました。 PTH1R の場合、50 nM の M-PTH(1-14)-HL647 または 20 nM の PTH'(1-34)-HL647 を使用しました。 蛍光強度は、Tb3+、HiLyte Fluor 488、および HiLyte Fluor 647 について、それぞれ励起波長 340 nm、発光波長 620 nm、520 nm、および 665 nM で Spark 蛍光プレートリーダー (Tecan) で測定しました。 FRETドナー蛍光強度とFRETアクセプター蛍光強度の比を計算した。 全結合は競合物質の非存在下で得られ、非特異的結合は 100 倍過剰の未標識ペプチドの存在下で測定されました。 データは、個々の実験ごとに特異的結合に対して正規化され、1 部位の異種競合方程式へのグローバル フィッティングによって分析されました。

シグナル伝達実験は、以前に記載されているように、一過性にトランスフェクトされた HEK293T 細胞を使用して全細胞に対して実行されました 11、14。 トランスフェクションの24時間後、細胞をPBSで洗浄し、細胞解離緩衝液(Gibco)で剥離し、再度PBSで洗浄した。 細胞をアッセイ緩​​衝液[10mM Hepes (pH 7.4)、146mM NaCl、1mM CaCl2、0.5mM MgCl2、4.2mM KCl、5.5mMグルコース、50mM LiCl、1mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン)に再懸濁した。 cAMPおよびIP1蓄積アッセイは、製造業者のプロトコールに従って、それぞれcAMP TbキットおよびIP-One Tbキット（両方ともCisBio製）を使用して、白色低容量384ウェルプレート（Greiner）上で実施した。 cAMPの蓄積のために、5000個の細胞を指定濃度のアゴニストとともにRTで30分間インキュベートしました。 基礎的な受容体シグナル伝達を測定するために、細胞をイソブチルメチルキサンチン (IBMX) 含有アッセイバッファー中でリガンドの非存在下で 30 分間インキュベートしました。 IP1 蓄積の場合、20,000 個の細胞を指定濃度のアゴニストとともに 37 °C で 2 時間インキュベートしました。 蛍光強度をSpark蛍光プレートリーダー(Tecan)で測定した。 濃度反応曲線を作成するために、データを 3 パラメーターのロジスティック方程式に当てはめました。

進化した受容体変異体の安定性は、膜の熱負荷後の残留受容体結合リガンドを測定することによって、一過的にトランスフェクトされたHEK293T細胞の膜画分において測定された。 PTH1R の場合、安定性の測定を TMD に限定するために ECD (残基 1 ～ 170) が発現構築物から除去されました。 NTR1 の場合、細胞は修飾されずに残されましたが、PTH1R の場合、細胞は上記のように膜を調製する前に 50 nM SNAP-Lumi-4Tb で標識されました。 次に、膜を氷上で、20 nM の [3,11-チロシル-3,5-3H(N)]-ニューロテンシン (Perkin Elmer) および 500 nM の M-PTH( NTR1 および PTH1R の場合はそれぞれ 1–14)-HL647。 示されている場合、リガンドを添加する前に、25 μM の mini-Gs タンパク質を膜画分に添加しました。 その後、96 ウェル プレートのウェルごとに 0.5 μg のメンブレンを分配し、PCR サーモサイクラーで特定の温度まで 20 分間加熱しました。 次いで、ＮＴＲ１含有膜をガラス繊維フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に固定化し、結合緩衝液で４回洗浄し、放射性リガンドの残留活性をＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｐｌｕｓ １４５０液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。 PTH1R については、上記のように HTRF によって残留リガンド結合を測定しました。 データは非線形回帰フィッティングによって分析されました。

フローサイトメトリーデータは、FlowJo ソフトウェア V10 (BD Biosciences) で分析されました。 データの収集と分析は Microsoft Excel V2108 で実行されました。 他のすべての統計分析と曲線フィッティングは Prism V6.07 (GraphPad) で実行されました。 各分析の詳細は、実験方法のセクション、特定の実験の図、表、および図の凡例に概説されています。 配列アラインメントとスネーク プロットは GPCRdb58 から取得しました。 配列解析は、CLC Workbench V22.0.2 を使用して実行されました。 配列頻度は WebLogo59 で視覚化されました。 タンパク質構造は、PyMOL V2.8.2 を使用して分析および視覚化されました。 差異の統計的有意性は、一元配置分散分析およびボンフェローニ多重比較によって決定されました。

サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。 分析から除外されたデータはありません。 実験はランダム化されていませんでした。 研究者らは、実験と結果の評価中に割り当てについて知らされていませんでした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

論文の結論を評価するために必要なすべてのデータは、論文および/または補足情報に記載されています。 この作業で使用される公開されている PDB エントリ: 4BUO、4L6R)。 この論文で使用されている受容体配列データは GPCRdb から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

ハウザー、AS et al. GPCR 薬物標的の薬理ゲノミクス。 セル 172、41–54.e19 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kobilka, BK & Deupi, X. G タンパク質共役受容体の立体構造の複雑さ。 トレンドファーマコル。 科学。 28、397–406 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Gilman、AG G タンパク質: 受容体が生成するシグナルのトランスデューサー。 Annu Rev. Biochem 56、615–649 (1987)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Oldham、WM & Hamm、HE G タンパク質共役受容体によるヘテロ三量体 G タンパク質の活性化。 ナット。 モル牧師。 細胞。 バイオル。 9、60–71 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

カリフォルニア州サーカーら。 発現、安定性、結合選択性のための G タンパク質共役受容体の指向性進化。 手順国立アカド。 科学。 USA 105、14808–14813 (2008)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Scott、DJ & Plückthun、A. ポリマーカプセル化細胞を使用した界面活性剤安定性 G タンパク質共役受容体の直接分子進化。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 425、662–677 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Klenk, C.、Ehrenmann, J.、Schütz, M. & Plückthun, A. 定方向進化による G タンパク質共役受容体の発現と熱安定性を改善するための一般的な選択システム。 科学。 議員第 6 号、21294 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シュッツ、M.ら。 真核生物の発現宿主におけるより高機能な生産のための、酵母におけるGタンパク質共役受容体の指向性進化。 科学。 議員番号 6、21508 (2016)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sarramegna, V.、Talmont, F.、Demange, P. & Milon, A. G タンパク質共役受容体の異種発現: 大規模生産と精製の観点からの発現系の比較。 細胞モル。 生命科学。 60、1529–1546 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

エグロフ、P. et al. 大腸菌における定向進化によって得られたシグナル伝達能のあるニューロテンシン受容体 1 の構造。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 111、E655–E662 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

エーレンマン、J.ら。 ペプチドアゴニストと複合体を形成した副甲状腺ホルモン 1 受容体の高解像度の結晶構造。 ナット。 構造体。 モル。 バイオル。 25、1086–1092 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schöppe、J. et al. 臨床的に使用されているアンタゴニストと複合体を形成したヒトニューロキニン 1 受容体の結晶構造。 ナット。 共通。 10、17 (2019)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Waltenspühl Y、Schöppe J、Ehrenmann J、Kummer L、Plückthun A. ヒトオキシトシン受容体の結晶構造。 科学 Adv. 6、eabb5419 (2020)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Deluigi, M. et al. ニューロテンシン受容体 1 と小分子リガンドの複合体は、完全、部分、および逆アゴニズムの構造決定因子を明らかにします。 科学。 上級 7、eabe5504 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

トム、C.ら。 Gq および Gs タンパク質と複合体を形成したニューロキニン 1 受容体の構造は、サブスタンス P の結合モードと独特の活性化の特徴を明らかにします。 科学。 上級 7、eabk2872 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ハイネ、P. et al. 精製された G タンパク質共役受容体を使用してリガンドを同定するハイスループット蛍光偏光アッセイ。 SLASディスコ。 24、915–927 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Deluigi, M. et al. α1B アドレナリン受容体の結晶構造は、選択的なリガンド認識の分子決定因子を明らかにします。 ナット。 共通。 13、1–13 (2022)。

記事 Google Scholar

ヘンデル、SJ およびショルダーズ、MD 哺乳動物細胞における進化の方向性。 ナット。 方法 18、346–357 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スターラー、MV et al. 指向性突然変異スキャンにより、ヒトの強力な活性化ドメインにおける酸性残基と疎水性残基の間のバランスが明らかになります。 セルシステム。 13、334–345.e5 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

フィンドレー、GM 他飽和ゲノム編集による BRCA1 変異体の正確な分類。 Nature 562、217–222 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

デュラント、MG 他。 大きな DNA 配列をヒトゲノムに効率的に組み込むためのリコンビナーゼの体系的な発見。 ナット。 バイオテクノロジー。 https://doi.org/10.1038/s41587-022-01494-w (2022)。

イングリッシュ、JGら。 哺乳類細胞における容易な指向性進化のためのプラットフォームとしての VEGAS。 セル 178、748–761.e17 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バーマン、ＣＭら。 ヒト細胞における指向性進化のための適応可能なプラットフォーム。 混雑する。 化学。 社会 140、18093–18103 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スミス、ES et al. 哺乳類細胞における致死性に基づく組換え遺伝子の選択: 腫瘍抗原の同定への応用。 ナット。 医学。 7、967–972 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Smith, ES、Shi, S.、Zauderer, M. ワクシニアウイルスにおける cDNA ライブラリーの構築。 方法 Ｍｏｌ． バイオル。 269、65–76 (2004)。

CAS PubMed Google Scholar

シュリンクマン、KM et al. 徹底的な組換えと進化により、界面活性剤の安定性と GPCR の機能発現を最大化します。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 422、414–428 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Rovati, GE、Capra, V. & Neubig, RR クラス AG タンパク質共役受容体の高度に保存された DRY モチーフ: 基底状態を超えたもの。 モル。 薬理学。 71、959–964 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Liu、X.ら。 GPCR-G タンパク質複合体形成のプロセスに関する構造的洞察。 セル 177、1243–1251.e12 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hillenbrand, M.、Schori, C.、Schöppe, J. & Plückthun, A. ヘテロ三量体 G タンパク質複合体の多様性と溶液中の GPCR との相互作用の包括的な分析。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 112、E1181–E1190 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krumm, BE、White, JF、Shah, P. & Grisshammer, R. ニューロテンシン受容体による G タンパク質活性化の構造的前提条件。 ナット。 共通。 6, 7895 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Chen, K.-YM、Keri, D. & Barth, P. G タンパク質共役受容体アロステリックシグナル伝達の計算設計。 ナット。 化学。 バイオル。 16、77–86 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ホワイト、ＫＬら。 GPCRシグナル伝達における活性化マイクロスイッチとアロステリックナトリウム部位の間の構造的接続。 構造 26、​​259–269.e5 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、C.ら。 ホルモン結合における副甲状腺ホルモン (PTH)/PTH 関連ペプチド受容体の細胞外領域の役割。 内分泌学 135、1488–1495 (1994)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bisello、A. et al. ヒト副甲状腺ホルモン/副甲状腺ホルモン関連タンパク質受容体の発現と機能におけるグリコシル化の役割。 生化学 35、15890–15895 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

グレース、CRR 他ペプチドリガンドと複合体を形成したB1型Gタンパク質共役受容体のN末端ドメインの構造。 手順国立アカド。 科学。 USA 104、4858–4863 (2007)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シミズ、Ｎ．、ディーン、Ｔ．、カトリ、Ａ．及びガーデラ、ＴＪ １位及び３位にα，α−ジアルキルアミノ酸を含むアミノ末端副甲状腺ホルモンフラグメント類似体。Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ． 解像度 19、2078–2086 (2004)。

記事 CAS Google Scholar

ラック医師、カーター医師、ガーデラ医師、副甲状腺ホルモン (PTH) の (1-14) フラグメントは、完全なアミノ末端切断型 PTH-1 受容体を活性化します。 モル。 内分泌。 13、670–680 (1999)。

CAS PubMed Google Scholar

趙、L.-H. 他。 活性型ヒト副甲状腺ホルモン受容体の構造と動態-1。 サイエンス 364、148–153 (2019)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhai、X.ら。 ペプチド誘導性 PTH1R 活性化の明確なシグナル伝達持続時間に関する分子的洞察。 ナット。 共通。 13、6276 (2022)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

小林和樹 ほか内因性リガンド認識とヒト PTH 受容体の構造遷移。 モル。 セル 82、3468–3483.e5 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

De Lean, A.、Stadel, JM & Lefkowitz, RJ 三元複合体モデルは、アデニル酸シクラーゼ共役β-アドレナリン作動性受容体のアゴニスト特異的結合特性を説明します。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 255、7108–7117 (1980)。

論文 PubMed Google Scholar

Devree、BT et al. Gタンパク質からGPCRのアゴニスト結合ポケットへのアロステリックカップリング。 ネイチャー 535、182–186 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ツァイ、C.-J. & Nussinov, R. 「アロステリーがどのように機能するか」についての統一された見解。 PLoS コンピューティング。 バイオル。 10、e1003394 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Carpenter, B. & Take, CG 最小限の G タンパク質を操作して、G タンパク質共役受容体の活性構造での結晶化を促進します。 タンパク質工学デス。 セル。 29、583–594 (2016)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van den Brulle、J. 他ハイスループット遺伝子合成のための新しい固相技術。 BioTechniques 45、340–343 (2008)。

論文 PubMed Google Scholar

Zhai、W.ら。 自然の配列風景に基づいて設計された合成抗体。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 412、55–71 (2011)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

ゲリング、RW et al. GIP(6-30アミド)はGIPの高親和性結合領域を含み、in vitroでのGIP1-42作用の強力な阻害剤です。 レギュラー。 ペプト。 69、151–154 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ラスムッセン、SGF et al. β2アドレナリン受容体-Gsタンパク質複合体の結晶構造。 Nature 477, 549–555 (2011)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ローゼンバウム、DM et al. 不可逆的アゴニスト-β(2) アドレナリン受容体複合体の構造と機能。 Nature 469、236–240 (2011)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Eps、N. 他 G タンパク質と活性化受容体が相互作用すると、α サブユニットのドメイン間界面が開きます。 手順国立アカド。 科学。 USA 108、9420–9424 (2011)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vuong, TM、Chabre, M. & Stryer, L. 視覚の環状ヌクレオチド カスケードにおけるトランスデューシンのミリ秒活性化。 Nature 311、659–661 (1984)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Chalmers, DT & Behan, DP 創薬および機能ゲノミクスにおける構成的に活性な GPCR の使用。 ナット。 Rev.DrugDiscov. 1、599–608 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kilpatrick, LE、Briddon, SJ、Hill, SJ & Holliday, ND 二分子蛍光相補によって測定された、神経ペプチド Y 受容体とベータアレスチン 2 の会合の定量分析。 Br. Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 160、892–906 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Vilardaga, J.-P.、Bünemann, M.、Krasel, C.、Castro, M. & Lohse, MJ 生細胞における G タンパク質共役受容体のミリ秒活性化スイッチの測定。 ナット。 バイオテクノロジー。 21、807–812 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hein, P.、Frank, M.、Hoffmann, C.、Lohse, MJ & Bünemann, M. 生細胞における受容体/G タンパク質結合のダイナミクス。 EMBO J. 24、4106–4114 (2005)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nikolaev, VO、Bünemann, M.、Hein, L.、Hannawacker, A. & Lohse, MJ 受容体誘導シグナル伝播用の新規単鎖 cAMP センサー。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 279、37215–37218 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ハインズ、TR et al. 二分子蛍光相補を使用した G タンパク質 βγ 二量体の視覚化により、細胞内ターゲティングにおける β と γ の両方の役割が実証されます。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 279、30279–30286 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kooistra、AJ et al. 2021 年の GPCRdb: GPCR 配列、構造、機能を統合。 核酸研究所 49、D335–D343 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

クルックス、GE、ホン、G.、チャンドニア、J.-M. & Brenner、SE WebLogo: シーケンス ロゴ ジェネレーター。 ゲノム研究所 14、1188–1190 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nygaard、R. et al. β(2) アドレナリン受容体活性化の動的なプロセス。 セル 152、532–542 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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専門家の技術支援をしていただいた Frank Murante 氏と Kari Viggiani 氏に感謝いたします。 また、ライブラリ設計に関して貴重なご意見をいただいた Pascal Egloff 氏にも感謝いたします。 この研究は、ドイツ科学アカデミー レオポルディナのフェローシップ (LPDS 2009-48) および欧州委員会のマリー キュリー フェローシップ (FP7-PEOPLE-2011-IEF #299208) によって CK に支援され、またシュヴァイツァー国立基金からの助成金によって支援されました。 (31003A_182334) AP へ

生化学部、チューリッヒ大学、Winterthurerstrasse 190、CH-8057、チューリッヒ、スイス

クリストフ・クレンク、アニナ・ニーデラー、アンドレアス・プリュックトゥーン

ワクチンックス社、1895 Mt. Hope Avenue、ロチェスター、ニューヨーク、14620、NY、米国

マリア・スクリブンズ、シューイン・シー、ロレッタ・ミュラー、エレイン・ガーズ、モーリス・ザウデラー、アーネスト・S・スミス

MorphoSys AG、Semmelweisstr. 7、82152、プラネック、ドイツ

ラルフ・ストロナー

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CK、ESS、MZ、および AP が設計した研究。 CK、MS、AN、SS、LM、EG が調査を実施しました。 RS は新しい試薬を提供しました。 CK、MS、AN、ESS、MZ、AP の分析データ。 CK と AP が論文を書きました。

Christoph Klenk または Andreas Plückthun との通信。

MS、SS、LM、EG、MZ、および ESS は、Vaccinex, Inc. の従業員であり、同社の株式および/またはストック オプションを所有しています。 RS は MorphoSys AG の従業員であり、競合する利益は存在しないことを宣言します。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献した Bryan Roth と他の匿名の査読者に感謝します。 査読レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Klenk, C.、Scrivens, M.、Niederer, A. 他。 哺乳類細胞における GPCR の指向性進化のためのワクシニアベースのシステム。 Nat Commun 14、1770 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37191-8

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受信日: 2022 年 11 月 10 日

受理日: 2023 年 3 月 6 日

発行日: 2023 年 3 月 30 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37191-8

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