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Aug 11, 2023

ミトコンドリアADP/ATPキャリアにおける基質結合はステップです

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 3585 (2022) この記事を引用

3325 アクセス

5 引用

27 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ミトコンドリアの ADP/ATP キャリアは、ADP をミトコンドリア マトリックスに輸入し、ATP をサイトゾルに輸送して細胞プロセスを促進します。 阻害された細胞質およびマトリックスの開放状態の構造により、交互アクセス輸送機構が確認されていますが、基質結合の分子詳細は未解決のままです。 ここでは、基質結合のプロセスにおける転座経路の溶媒にさらされた残基の役割を評価します。 我々は、ADP と ATP を両方の状態で結合する、3 つの正に荷電した脂肪族残基と芳香族残基のセットからなる主な結合部位を特定しました。 さらに、この部位の反対側には、状態依存的に基質結合に関与する 2 対のアスパラギン/アルギニン残基があります。 したがって、基質は一連の結合姿勢を経て方向付けられ、その転座につながる担体の構造変化を誘導します。 この部位の特性は、アデニン ヌクレオチド輸送の起電力性および可逆的性質を説明します。

真核細胞の生存力と機能は、ミトコンドリアとサイトゾルの代謝経路を維持し、細胞小器官と細胞の維持のための化合物を提供するために、不透過性のミトコンドリア内膜を通過する代謝産物とイオンの輸送に依存しています。 これらの化合物の大部分は、ヒトにおける最大の溶質キャリアファミリーであるミトコンドリアキャリアファミリー (SLC25) によって輸送されます 1、2、3。 ミトコンドリアの ADP/ATP キャリアは、アデニン ヌクレオチド トランスロカーゼとも呼ばれ、人体の最も多量の輸送ステップの 1 つを実行します。 キャリアは、ATP シンターゼによる ATP への変換のためにサイトゾル ADP をミトコンドリア マトリックスに輸入し、ATP を細胞質と合流する膜間腔に輸送して、細胞のエネルギーを必要とするプロセスに動力を供給します。酸化的リン酸化４． キャリアは、基質結合部位がこれらのコンパートメントに向かって向いているため、慣習的にマトリックス開放状態と細胞質開放状態と呼ばれる 2 つの状態の間を循環します 5、6。 機能的および構造的研究は、状態特異的阻害剤の利用可能性によって助けられてきた。 このキャリアは、アトラクチロシド (ATR)7 およびカルボキシアトラチロシド (CATR)8,9 によって細胞質開放状態にロックされ、一方、ボンクレキン酸 (BKA)10,11,12 によってマトリックス開放状態にロックされます。 阻害は基質の結合を防ぎ、輸送サイクルの一部ではない構造的立体配座にキャリアを捕捉することによって達成されるため、阻害剤結合状態は両方とも不成立となります 5,6。

ほとんどの SLC25 メンバーと同様に、ADP/ATP キャリアは、それぞれ約 100 アミノ酸の 3 つの相同配列反復から構成され 13、基質の中心転座経路を持つ 3 重の擬似対称構造に折り畳まれます 14。 CATR結合細胞質開放状態にあるウシADP/ATPキャリアの原子構造は、各配列反復が奇数の膜貫通αヘリックス（H1、H3、H5）からなるドメインをコードしていることを示した。マトリックス側の膜に平行に走るヘリックス（h12、h34、h56）と偶数の膜貫通αヘリックス（H2、H4、H6）15（補足図1）。 この基本的なトポロジーは、CATR 結合細胞質開放状態 16 および BKA 結合マトリックス開放状態 17 にロックされた真菌 ADP/ATP キャリアの原子構造によって確認されました。

3 つのドメインのそれぞれにおいて、奇数番目のヘリックス、マトリックス ヘリックス、および「接点」17、18、19 への偶数番目のヘリックスの N 末端部分がコア要素を構成し、C 末端は偶数番号のらせんの一部はゲート要素17を形成します（補足図1）。 2 つの状態間の相互変換は交互に起こり 20、6 つの構造要素の広範な移動が関与するため、ADP/ATP キャリアはこれまでに確認されている中で最も動的な溶質輸送体となっています 5,17。 3 つのゲート要素は担体の細胞質側を開閉し、3 つのコア要素はマトリックス側を交互に開閉します。 開閉は、2 つの塩橋ネットワークとブレースの破壊と形成によって制御されます。1 つは、[PS]x[DE]xx[KR] モチーフのマトリックス塩橋ネットワーク 15,16 と、コア要素と細胞質上のグルタミンブレース 16 です。ゲート要素上の [FY][DE]xx[RK] モチーフ 17、20、21 およびチロシン中括弧 17 の塩橋ネットワーク (補足図 1)。 これら 6 つの構造要素の調整された動きは、唯一の直接的なエネルギー入力源としての基質の結合と放出によって駆動されます 22,23。

輸送サイクルでは、基質結合と構造変化は相互に依存するプロセスです。これは、細胞質開放状態から閉塞状態を経てマトリックス開放状態に至る、非常に動的な基質結合状態が連続的に存在する必要があることを意味します。戻る。 このプロセス中に、キャリアが異なる立体配座間で切り替わるため、ADP 分子と ATP 分子は多くの異なる配座異性体を採用する可能性があります。 したがって、直接構造分析によって対処する前に、この複雑なプロセスを解き明かす必要があります。

構造が利用可能になる前に実施された、輸送不可能なヌクレオチド類似体を使用した生化学的研究では、マトリックスループ 24、25、26、27 および C 末端領域 27 の基質結合部位が提案されています。 その後、化学的制約と距離制約 18,19 または擬似対称性の逸脱 20 を概念として使用したシーケンス解析により、3 つの「接触点」18,19 を含むキャビティの中央部分の位置が示されました (補足図 1)。 。 対照的に、分子動力学シミュレーションでは、転座経路全体にわたる基質相互作用が強調されました 28、29、30、31。 明らかに、さまざまな研究は基質結合部位の共通の位置を示していないため、その実験的決定は、基質結合とミトコンドリアADP/ATPキャリアの立体構造カップリングという重要な問題に取り組む上で重要な最初のステップとなるだろう。

ここでは、基質移行経路のアラニン置換変異体を使用し、機能アッセイと結合研究を組み合わせることで、基質結合に関与する残基を直接実験的に同定します（図1）。 私たちのアプローチは、立体構造状態に関係なく、基質と相互作用するすべての残基を特定します。 結合部位残基の同定は、結合および輸送機構の重要な分子詳細を解明するための枠組みを提供します。 重要なことに、ADP と ATP の結合に関与する残基は同じであり、これが輸送の完全に可逆的な電気発生的性質を説明しています。

細胞質が開いた状態の TtAac の相同性モデル (左) とマトリックスが開いた状態の TtAac の実験的に決定された構造 (右) の膜図 (PDB コード: 6gci 鎖 A)。 この研究で分析された残基は黄色の棒で示され、マトリックスおよび細胞質ネットワークの残基は黒い棒で示され、イオン相互作用はマゼンタの破線で示されます。 HOLE59 によって決定される水にアクセス可能な表面は、透明な青色で示されます。 b この研究で分析された、移行経路を裏打ちする膜貫通ヘリックスの残基は青色で標識され、塩橋ネットワークの残基は黒色で標識されている。

基質結合に関与する可能性のある残基を同定するために、真菌サーモセロマイセス・サーモフィラ（TtAac）のミトコンドリアADP/ATPキャリアー中の水にアクセス可能な残基を分析しました。TtAacは、酵母オルソログよりも界面活性剤中でより安定です32。 すべての候補残基を同定するために、実験的に決定された TtAac17 のマトリックス開放構造と、細胞質開放状態の解明された構造 (PDB エントリー 1okc、4c9h、4c9q、および 4c9j) に基づく細胞質開放状態の比較相同性モデルを使用しました。 ）。 合計 36 個の残基が転座経路で同定され、2 つの塩橋ネットワークを除く溶媒にアクセス可能なすべての残基が含まれます。塩橋ネットワークは基質特異性に関係なく普遍的に保存されており、機構において定義された役割を持っています 15,16。 17、20、21（図1）。 選択された各残基がアラニンに置換され、36 個のバリアントのセットが生成されました。

まず、Saccharomyces cerevisiae の輸送欠損 WB-12 株を用いて機能補完研究を行いました 33。 野生型 TtAac の発現は WB-12 の増殖を完全に回復しましたが (100% 相補)、空のベクターを含むコントロールでは増殖は示されませんでした (補足図 2)。 36個のアラニン変異体のうち、野生型と同程度に増殖を補ったのは5個だけでしたが、19個はまったく増殖を示さず（3％未満）、別の12個は著しく増殖が低下しました（18〜76％の範囲）（図2a） 、補足図2）。 機能に必須の19残基は中央空洞全体に分散しており（図2b）、ADP / ATPキャリアオルソログ間で高度に保存されています（補足図3）。 荷電残基 K30、R88、R197、R246 および R287 は、他のオルソログの増殖および輸送活性に重要であることが以前に示されています 34、35、36、37、38、39。 これらのデータは、転座経路のほとんどの残基が効率的な ADP/ATP 交換に重要であることを示しました。

a YPG培地での段階希釈スポットテストの濃度測定によって決定された、野生型キャリアの発現と比較したTtAac変異体を発現するWB-12株の機能的相補の割合（100％相補）（補足図2）。 バーとエラーバーは、4 つの独立した実験の平均値と標準偏差を表します。 「方法」に記載されているように、有意性分析は両側 1 サンプル t 検定で実行されました (p > 0.05、ns; p ≤ 0.05、*; p ≤ 0.01、**; p ≤ 0.001、***; p ≤ 0.0001、****)。 色は観察された 3 つの成長特性を表します。成長は有意に影響を受けない (ns)、水色。 成長が著しく影響を受ける (0.5 ≥ p > 0.0001)、海洋。 成長なし (p ≤ 0.0001)、濃い青色。 b マトリックスが開いた BKA 結合 TtAac 構造 (PDB コード: 6gci 鎖 A) 内の分析された残基の位置。漫画表現として示されています。 球は CA 炭素原子を表し、a で説明したように色分けされています。 この図のソース データは、ソース データ ファイルとして提供されます。

相補性アッセイでは、構造または機能のどの側面が変異によって影響を受けるかを決定することはできません。 輸送機構の重要な側面である基質の結合親和性が低いため (μM 範囲 23)、結合アッセイを使用することができません。 相補性アッセイでは基質結合に特異的に関与する残基を同定できないため、チオール反応性プローブ 7-ジエチルアミノ-3-(4-マレイミドフェニル)-4-メチル クマリン ( CPM) 温度上昇中40。 見かけの融解温度 (Tm) は、展開速度が最大となる点での熱安定性 32 のパラメーターとして取得できます。 CPM アッセイは、さまざまな条件下での膜タンパク質の折り畳み状態と安定性を評価するために使用できます 32、41、42。 さらに、熱安定性プロファイルの変化は、阻害剤 17、21、32、43 および他のエフェクター 44 の結合に関する情報を提供します。 最近、タンパク質と基質分子の間に特異的な相互作用が形成されるため、輸送タンパク質への基質の結合時にもシフトが発生する可能性があることが実証されました 32,45。 原理的には、突然変異によるこれらの相互作用の破壊は、基質誘発性の熱安定性シフトの減少につながり、基質結合に直接関与する残基を同定する方法を提供すると考えられる。

熱安定性シフト実験を行うために、W303-1B 酵母株で発現させた精製タンパク質を使用しました。これにより、機能的活性に関係なく、36 種類すべての変異体の過剰発現が可能になりました。 すべての変異体は同様のレベルで発現され、ミトコンドリアを正確に標的としていました。 ニッケルアフィニティー結合とカラム上のアフィニティータグ切断を使用して、それらは正常に精製されました（補足図4）。 それらの折り畳み状態と構造的完全性を、特異的阻害剤 CATR および BKA17、21、32 の存在下および非存在下で CPM アッセイで評価しました (図 3)。 見かけの Tm は野生型 (50.2 ± 0.6 °C) と有意差がなかったため (48.2 ～ 52.8 °C)、ほとんどの変異体の安定性は個々の変異の影響を受けませんでした (図 3a)。 例外は変異体L41A、Q44A、T146A、Y239AおよびN284Aであり、高い初期蛍光とシグモイド展開曲線の欠如によって判断されるように、展開状態にありました（補足図5a）。 特に、これらの残基はすべてマトリックス ゲート内に位置しています (補足図 5b、c)。 マトリックスゲートは絶縁層を提供し、キャリアが細胞質開放状態にあるときにプロトンの漏れによるプロトン推進力の散逸を防ぎます17。 さらに、残基 Q44 は H1 と H516 の間のグルタミンブレースです。

エフェクターの非存在下（上）、または CATR（中央）または BKA の存在下（下）における各タンパク質の CPM 熱安定性データ。 バーとエラーバーは、野生型については 8 回、変異体については 2 ～ 7 回の独立した実験の平均値とサンプル標準偏差を表します。 「方法」で説明したように、各条件の有意性分析は一元配置分散分析を使用して実行されました。 有意な値のみを示します (p > 0.01、ns; p ≤ 0.01、*; p ≤ 0.001、**; p ≤ 0.0001、***; p ≤ 0.00001、****)。 b CATRと複合体を形成したScAac2の細胞質開放状態構造の側面図（PDBコード：4c9h鎖A）。 ScAac2 の相互作用残基は、TtAac の R100 である K104 を除いて TtAac で保存されており、2 つのタンパク質は 74% の配列同一性を共有します。 比較を容易にするために、TtAac ラベルを使用しました (補足図 3)。 イオン相互作用 (黄色の点線) と CATR (海洋) との疎水性接触を形成する残基は、それぞれ濃い青と茶色で示されています。 ScAac2 の残基 K104 は、TtAac の Arg (R100) にモデル化されています。 c BKA結合したTtAacのマトリックス開放構造のマトリックス図（PDBコード：6gciチェーンA）。 BKA (オレンジ) とイオン相互作用 (黄色の破線) または水素結合 (黒の破線) を形成する残基は紫色で示され、疎水性接触を形成する残基はシアン色で示されます。 この図のソース データは、ソース データ ファイルとして提供されます。

重要なのは、より高い見かけの Tm 値への変化から明らかなように、非リガンド状態から始まる 31 個の折りたたまれた変異体すべてが両方の阻害剤に結合でき、リガンド非結合キャリアが折りたたまれていることが確認されました。 変異残基が阻害剤との特異的相互作用に関与する場合にのみ、観察される熱シフトの減少または消失が見られます。 このようにして、阻害剤の結合部位をマッピングすることができました（図3b、c）。これは、CATR結合状態およびBKA結合状態の構造で観察されたほとんどの相互作用とよく一致しました15、16、17。 熱安定性データは溶液中のキャリアを使用して 25 ～ 90 °C の温度範囲で測定されるのに対し、結晶構造は液体窒素中で -196 °C で決定されるという事実を考慮すると、この一致は注目に値します。 いくつかの明らかな矛盾については、さらなるコメントが必要です。 ウシの構造 15 は、K30 と R246 の同等の残基が規則的な水を介して CATR と相互作用することを示しており、関連するアラニン変異体で観察されたシフトの減少と一致します (図 3b)。 残基 L135 および V138 は、CATR のイソ吉草酸基とファンデルワールス接触を形成する可能性があります。 BKA の場合、変異体 F97A、R100A、N123A、Y204A、および L295A は、これらの残基が結合に直接関与していないにもかかわらず、シフトが大幅に減少しました。 これらは、マトリックスが開いた状態のチロシンブレースおよび疎水性プラグの一部であり 17 、そのため、BKA の結合の要件であるその形成に重要です。 細胞質ネットワークを構成する残基についても同様の観察が行われました 21。 全体として、阻害剤分析は、このアッセイをタンパク質-リガンド相互作用に関与する残基の検出に使用できるという原理の証明を提供しました。 さらに、熱安定性データは、5 つのバリアント (補足図 5) を除いて、すべてのリガンド非結合タンパク質がよく折りたたまれており、基質結合分析に適していることを集合的に証明しました。

次に、リガンドのないキャリアを使用して、基質による熱安定性の変化を特徴付けるための適切な濃度範囲を決定しました。 シフトは、各基質濃度での見かけの Tm から基質の非存在下でのタンパク質特異的な見かけの Tm を差し引くことによって計算された ΔTm 値として表されました。 以前の研究45と一致して、野生型のΔTm値は、12 mMで飽和するまで濃度依存的に増加しました（ΔTm = 8.9±1.8℃）（補足図6）。 この滴定実験に基づいて、ADP および ATP の 5 つの代表的な濃度 (0.1、0.5、1、5、10 mM) が、変異体の応答をテストするために選択されました。 基質のオン速度とオフ速度は温度の上昇とともに増加し、タンパク質のアンフォールディングと標識は不可逆的であるため、これらの測定は速度論的評価を提供しないことに注意してください。 プラトーは、基質の結合がこれらの高温での展開を防ぐことができないために発生します。

続いて、31 個すべての折り畳まれた変異体について、ADP および ATP の存在下での熱安定性の変化を測定しました。 基質に対する反応に関して、それらは 3 つのクラスに分類されました (図 4、5)。 最初のクラスでは、変異体K30A、R88A、R197A、R246AおよびR287Aは、いずれの基質の存在下でも濃度依存的な熱安定性の変化を示さなかった（図4a）。これは、これらの残基のそれぞれが基質と重要な相互作用を形成していることを示している。 変異体は相補性アッセイにおいて一貫して増殖を示さなかった（図２ａ、補足図２）。 これらの正に帯電した残留物は水で満たされた空洞の中央に見られ（図4c）、それらのアラニン置換により正電荷が失われます。

a、b 野生型および単一アラニン置換変異体の基質濃度 0.1、0.5、1、5、10 mM で測定された熱安定性シフト値 (ΔTm)。 円とエラーバーは、野生型では 8 回の独立した実験、変異型では 3 ～ 7 回の独立した実験の平均と標準偏差を表します。 白丸と黒丸はそれぞれ ADP と ATP を表します。 野生型タンパク質のデータは黒色で示され、変異型タンパク質のデータは重要な残基および重要な残基についてそれぞれ赤色 (a) またはオレンジ色 (b) で示されます。 いくつかのデータ ポイントでは、ADP グループと ATP グループの平均値とエラーバーが同一であるため、それらのグラフ表示が ADP マーカーを上にして重ねて表示されることに注意してください。 誤差範囲は記号によってマスクされる場合があります。 「方法」で説明したように、有意差は交互作用を伴う二元配置分散分析によって評価されました。 有意な値 (p ≤ 0.01) は、ADP および ATP についてそれぞれ * または # で示されます。 c TtAac マトリックスが開いた BKA 結合構造 (PDB コード: 6gci 鎖 A) (左) と Gly 表現の赤またはオレンジ色の棒および球で分析された残基を示す拡大図 (右)。 ヘリックスは小麦の漫画表現で示され、ラベルが付けられています。 この図のソース データは、ソース データ ファイルとして提供されます。

a、b 野生型および単一アラニン置換変異体の基質濃度 0.1、0.5、1、5、10 mM で測定された熱安定性シフト値 (ΔTm)。 円とエラーバーは、野生型では 8 回の独立した実験、変異型では 3 ～ 5 回の独立した実験の平均と標準偏差を表します。 白丸と黒丸はそれぞれ ADP と ATP を表します。 野生型タンパク質のデータは黒で示され、バリアントのデータは緑で示されます。 場合によっては、ADP グループと ATP グループの平均値とエラーバーが同一であるため、それらのグラフ表示が ADP マーカーを上にして重ねて表示されることに注意してください。 表示されていない場合、エラーバーは記号よりも小さくなります。 統計的評価は「方法」に記載されているように実行されました。 有意な値 (p ≤ 0.01) は、ADP および ATP についてそれぞれ * または # で示されます。 c TtAac マトリックスが開いた BKA 結合構造 (PDB コード: 6gci 鎖 A) (左) と Gly 表現の緑色の棒と球の分析された残基を示す拡大図 (右)。 ヘリックスは小麦の漫画表現で示され、ラベルが付けられています。 この図のソース データは、ソース データ ファイルとして提供されます。

2番目のクラスのアラニン置換変異体には6つの残基（N85、N96、L135、V138、G192およびY196）が含まれており、これらは5つの重要な残基の近くにあり、野生型と比較して熱安定性プロファイルが大幅に変化していました（図4b） ）。 これらの変異体は基質の存在下で濃度依存的な変化を示しましたが、それらは野生型タンパク質の変化よりも大幅に小さかったです。 有意差は、ADP と ATP の両方について、試験した 2 つの最高濃度でほとんど得られました (図 4b)。 基質誘発性のシフトは完全には消失していないため、各残基が基質結合に寄与します。 それらの寄与する役割を裏付けるように、変異体 L135A、G192A および Y196A は相補性研究ではまったく増殖しませんでしたが (<3%)、一方、N85A、N96A および V138A の増殖は著しく減少しました (42 ± 23%、18 ± 10%、および 53 ±それぞれ14％）（図2a、補足図2）。 注目すべきことに、これら2つのクラスの11の変異体のいずれにおいても、アラニン置換はタンパク質の不安定性や結合ポケットの障害を引き起こさなかった（図3）。これは、観察された効果が確かに基質結合に特異的であることを強調している。

重要なことは、3 番目のクラスの変異体には 31 変異体のうち 20 変異体が含まれており、野生型タンパク質の変異体と有意差のない基質誘導性シフトが示されたことです (図 5)。 変異タンパク質S29A、V230A、G288AおよびG291Aの熱安定性シフトは、ADPおよびATPのどの濃度でも野生型と変わらず（図5a）、これらの変異体は完全に機能しました（図2a、補足図2）。 変異体F97A、S189A、Y204、G235AおよびL295Aは成長を相補せず、T92A、Q93A、R100A、S134、Y200A、T231AおよびS238Aは部分的にしか相補しませんでしたが（図2a、補足図2）、それらはすべて以下と同様の熱安定性シフトを示しました。基質の存在下での野生型タンパク質 (図 5a)。 これらの結果は、これらの変異が輸送機構の重要なステップに影響を与えるが、基質結合には影響を及ぼさないことを示している。

4 つの変異体は野生型といくつかの違いを示しましたが、一貫性はありませんでした。 変異体 Y89A は部分的に（36 ± 19%）増殖を補完できましたが（図 2a）、両方のヌクレオチドについて野生型よりも大きなシフトを示し（ADP についてのみ有意）（図 5b）、この残基が直接関与していないことを示しています。基質結合。 変異体 N123A は部分的に活性 (50 ± 9%) (図 2a)、基質誘発シフトは 5 mM でのみ野生型と大きく異なりました (図 5b)。 変異体 V294 を発現する株は、グリセロール上で野生型レベル (84 ± 14%) まで増殖し (図 2a)、精製タンパク質は野生型 (50.2 ± 0.6 ℃) よりも安定でした (53.7 ± 0.5 ℃)。図3a)。 これは、低い基質濃度では誤った有意性をもたらしましたが、ATPの最高濃度では野生型レベルに達しました（図5b）。 最後に、変異体タンパク質 I193A の安定性は非常にばらつきがあり (図 5b、3a)、基質誘発性の変化の重要性を評価することができませんでした。

基質結合に関与しない残基は、転座経路全体に位置していましたが、基質結合に関与していることが示された残基のすぐ近くにも位置していました（図5c）。 これらの結果は、熱安定性シフトアッセイがタンパク質と基質の相互作用に関与する個々の残基を正確に同定できること、および基質結合が転座経路内の残基のクラスターに限定されることを示しています。 注目すべきことに、試験したすべてのタンパク質について、どの基質濃度でもADPまたはATPによって誘発される熱シフト間に有意差はありませんでした（補足図7）。

ミトコンドリアの ADP/ATP キャリアは、ミトコンドリア内膜を通過する ADP と ATP の高い流量を達成して、私たちの日常活動を維持できる独自の機能を備えています。 さらに、それらは、呼吸鎖によってミトコンドリア内膜を横切って生成される大きな電気化学ポテンシャルに対抗して、負に帯電したADPをインポートするという課題を乗り越えるために進化しました。 55年以上研究されてきたにもかかわらず、輸送機構、特に基質結合と、マトリックスと細胞質の開放状態の間の相互変換に及ぼす基質結合の影響については、依然として多くの未解決の疑問が残っている。

基質結合部位の位置については多くの提案がなされています 19、20、24、25、26、27、28、29、30、31 が、ここでは関連する基質を使用して実験的にこの問題に取り組みます。 私たちのアプローチにより、基質結合プロセスの完全な評価が可能になり、重要な相互作用のみが強調表示されます。 2つの塩橋ネットワーク間の転座経路のすべての残基を調査した結果、基質結合に重要かつ寄与する役割を持つ残基を特定し、それらが転座経路のほぼ中間でクラスター化していることを示しました。 単一の突然変異が結合を完全に消失させることができるという観察は、以前に主張されているように、マトリックスループやC末端領域など、他の場所に重要な基質結合部位が存在しないことを示しています24、25、26、27。 「チロシンラダー」15、28の相互作用を含め、他の観察された相互作用28、29、30、31は一時的なものである可能性がありますが、実験的な裏付けは見つかりません。 さらに、ADPおよびATPによって誘発される熱安定性の変化は、テストしたタンパク質のいずれの濃度でも互いに統計的に異ならなかったので（補足図7）、両方の基質は同様の方法で同じ残基セットに結合する必要があります（図7）。 .6）。 ADP/ATP キャリアがモノマーとして機能することを考えると 14、17、46、47、48、49、50、輸入と輸出のステップは連続している必要があり、これはピンポン運動機構を意味します。

ミトコンドリアADP/ATPキャリアの細胞質開放状態（左）（ScAac2、PDBコード4c9h鎖A）とマトリックス開放状態（PDBコード6gci鎖A）（右）の膜からの側面図。 ScAac2の相互作用残基はTtAacで保存されており、比較を容易にするためにTtAac標識を使用しました（補足図3）。 HOLE59 によって決定される水にアクセス可能な表面は、透明な青色で示されます。 基質の結合において決定的かつ重要な役割を果たす水で満たされた空洞の残留物は、それぞれ赤とオレンジで表され、基質の ADP と ATP はそれぞれ緑とシアンで示されます。 水にアクセス可能な表面は青色で表示されます。

正に荷電した残基K30、R88、R197、R246およびR287の場合、個々のアラニン置換により機能が失われ（図2a）、基質誘発の熱安定性シフトが完全に消失しました（図4a）。 それらの化学的特性を考慮すると、これらの残基はヌクレオチドの負に帯電したリン酸基とイオン相互作用をしている可能性があります。 このように、それらは基質結合の全体的な相互作用エネルギーに比較的大きく寄与し、輸送に必要な構造変化を促進します 22,23。 一方、残基N85、N96、L135、V138、G192およびY196のアラニン置換は、機能の部分的または完全な喪失をもたらし（図2a）、基質の存在下での熱安定性のシフトが大幅に減少しました（図4b）。 これらの残基の化学的性質と相対的な位置を考慮すると、それらは比較的疎水性のアデノシン部分の結合に共同で関与し、前述の荷電残基よりも弱い相互作用、すなわち疎水性および芳香族スタッキング相互作用を形成すると考えられます。 したがって、基質結合の全体的な相互作用エネルギーに対する個々の寄与は小さくなります。

基質の化学的性質と距離の制約を考慮した以前の配列解析では、基質の結合に関与する 3 つの「接触点」があり、これらは SLC25 ファミリーのすべてのメンバーに共通であり、偶数の膜貫通ヘリックス上に見られると提案されていました 18。 19. その後、それらはタンパク質ドメインのコア要素とゲート要素の間にヒンジポイントも形成し、したがって基質の結合を共通の輸送機構に結び付けることが発見されました4、5、17。 この研究で特定された重要な残基、H2 および H6 上の R88 および R287 は、それぞれ接触点 I および III に対応します。 H1 上の重要な残基 K30 は、それらの間の中央空洞内の同じ高さに位置します。 結合に重要な寄与をする残基、H4 上の G192 および Y196 は接触点 II にあり、L135 および V138 は近くにあります。 これら 7 残基はすべて、両方の構造状態でアクセス可能であり、同様の配座異性体を持っています (図 6)。これは、これらが共同して基質結合に関与し、構造変化全体を通じて主要な基質結合部位を形成していることを示しています。 この部位の中心位置は、キャリアが状態間を切り替える際の、両側のマトリックスおよび細胞質ゲートの形成および破壊と一致しています4、5、17。 さらに、それは輸送サイクル中に起こるすべての構造変化の支点であることも示されました17。

残りの 4 残基は、メイン部位の反対側に位置する 2 つのアスパラギン/アルギニンペア、N85/R246 および N96/R197 を形成します。 これらは同じ化学的特性を持っているため、同様の役割を果たすことができます。 細胞質とマトリックスの開放構造を比較すると、これらの Asn/Arg ペアが状態依存的に配座異性体を変化させることが明確に示されています (図 6)。 細胞質が開いた状態では、残基 N96/R197 は空洞の開口部を向いていますが、マトリックスが開いた状態ではこれらは主要な結合部位の一部です。 逆に、残基 N85/R246 はマトリックスが開いた状態では空洞の開口部を向いていますが、細胞質が開いた状態では主要な結合部位の一部になります (図 6)。 これらのペアは空洞の開口部を指しているため、ヌクレオチドの最初の結合と最終的な放出に関与している可能性があります。

要約すると、アデノシン部分には 1 つの結合部位があり、リン酸部分の結合には正に荷電した極性残基がいくつかあり、これらは状態依存または状態独立に関与しており、段階的なプロセスを示しています。 輸送サイクルにおけるそれらの役割は段階的なメカニズムで説明でき、これが基質結合事象の現在のモデルです。 まず、ADPはブラウン運動と静電引力によって細胞質状態のキャリアの空洞に入り28、29、30、リン酸部分がN96/R197ペアと結合します（図7a）。 ADP の疎水性アデニン部分は、結合すると基質認識のために疎水性/芳香族結合部位 (G192、Y196、L135 および V138) に自由に結合し、水相から保護します (図 7b)18、19、51。 ミトコンドリアの ADP/ATP キャリアは特異性が狭く、ADP、ATP、およびそれらのデオキシ変異体のみを輸送するため、これは重要なステップです 30,51。 次に、負に帯電したリン酸部分が主結合部位の正に帯電したK30、R88、R287に結合し、ADP分子を中央領域に配置してその電荷を中和します（図7c）。 結合部位のすべての接触点が結合され、次の段階に進むことができます。 ADPの末端リン酸塩はN85/R246ペアと結合し始め（図7d）、閉塞状態（図7e）およびマトリックス開放状態（図7f）への構造変化が継続する。 図 7d と同様ではあるが同一ではない姿勢が MD シミュレーションで観察されました 28,30 が、シミュレーション時間 (<1 μs) は半サイクル (~0.5 ms) を完了するには短すぎました。 最後に、N85/R246ペアはADPを腔の口に近づけ、ATP合成のためにミトコンドリアマトリックスに放出します（図7f）。 新たに合成された ATP は、同様の一連の相互作用と構造変化 4,5,17 でキャリアによってミトコンドリアの外に輸送されますが、逆に起こります (図 7g-l)。

輸送サイクルのさまざまな段階、a〜d、lは細胞質が開いた状態、e、kは閉塞状態、f〜jはマトリックスが開いた状態です。 基質である ADP と ATP には、アデニン部分 (それぞれ緑色とシアン)、リボース部分 (黄色)、および 2 つまたは 3 つのリン酸部分 (オレンジ色) があります。 アデノシン結合部位は馬蹄形で表され、結合部位の正に帯電した極性残基はそれぞれ青と緑で示されています。 黒い矢印は状態間の変換を引き起こす基板の動きを示し、赤い矢印は基板の出入りを示します。

この段階的な方法では、大きくて構造的に多様な ADP および ATP 分子は、それらの転座に必要な複雑な構造変化を伴う一連の配座異性体を介して方向付けられます。 さらに、両側に2つのAsn/Argペアがある中央部位の位置は、基質が来た方向とは無関係に同様の一連の相互作用を経ることを示しており、観察された輸送の可逆的性質を説明している。 以前の観察と一致して、輸送の方向はタンパク質の特性によって決定されるのではなく、基質の化学勾配と膜電位によって決定されます。

さらに、同定された結合残基の静電特性は、ミトコンドリアにおけるアデニンヌクレオチド輸送の生体エネルギー学の重要な側面を説明できる可能性がある。 ADP のインポート中に 3 つのマイナス電荷が膜電位に対して移動しますが、ATP のエクスポート中に 4 つのマイナス電荷が膜電位とともに移動します。 電荷の動きは、ケージドヌクレオチドを使用して直接測定されており、ADP インポートステップでは +0.3 または +0.5、ATP エクスポートステップでは -0.7 または -0.5 の値が得られます 52,53。 これらの観察に基づいて、基質結合部位は 3.3 または 3.5 個の正のカウンターチャージを含むべきであることが提案されました 52,53。 これらの測定値は、キャリアの立体構造が変化するにつれて、基質とともに他のコンパートメントに再配向する主要結合部位の K30、R88、および R287 の 3 つの正電荷とよく一致します。 部分電荷は、一時的で本質的に弱い R197 または R246 の状態依存相互作用によるものである可能性があります。 部分電荷は、大きな膜電位の存在下で ADP の輸入と ATP の輸出の両方を刺激し、閉塞状態で結合した基質にかかる電気泳動力を最小限に抑えます。 観察された ADP と ATP の等モル交換は、基質結合部位の特性によって決定されるのではなく、基質の非存在下での立体構造変化を防ぐ 2 つの塩橋ネットワークによって決定されます。 基質結合のみがネットワークを破壊するためのエネルギー入力を提供するため、構造変化を引き起こし 22,23 、従って 2 つの基質は 1 対 1 で交換されます。

興味深いことに、変異体 K30A、R88A、および R287A は、中央空洞内に近接して位置する正電荷の 1 つ。 したがって、キャリアが立体構造を変えるときにこれら 3 つの正電荷の反発によって課せられる高いエネルギー障壁のため、基質の非存在下ではキャリアの状態間の相互変換が妨げられる可能性があります。 負に帯電した ADP および ATP がこれらの残基に結合すると、それらが中和されて自由エネルギーが低下し、基質の移動が引き起こされます。 ヘリックス間残基に影響を与える G291A および V294A 変異 17 は動態を妨げる可能性がありますが、チロシン括弧 17 に相当する R100A は細胞質ネットワークを弱める可能性があり、確率的に細胞質が開いた状態になる可能性が高くなります。 したがって、これらの変異は状態の相互変換を不利にし、より安定した変異体をもたらします (図 3)。

結論として、同定された結合部位の特性は、これまで分子的に説明できなかったメカニズムの多くの特徴を説明します。 ここで発見されたのと同じ原理が、現在研究中のSLC25ミトコンドリアキャリアファミリーの他のメンバーの基質の結合と輸送にも当てはまる可能性がある。

研究の対象は、サーモセロミセス・サーモフィラのミトコンドリアADP/ATPキャリアーでした。 野生型ミトコンドリア ADP/ATP キャリアの発現のために、遺伝子をコドン最適化し、リン酸キャリア pic2 の構成的に活性な pPIC2 プロモーターを含む pYES3/CT 派生ベクター (カリフォルニア州カールスバッド、米国インビトロジェン) にクローニングしました。出芽酵母21,46。 KOD HotStartポリメラーゼ（Novagen）によるオーバーラップエクステンションPCR54を使用して、関連するコドンをGCT（酵母ゲノムにおけるアラニンの最も頻度の高いコドン）で置換することにより、各変異体について示された位置に単一のアラニン置換を導入した。 変異を導入するためのプライマーを補足表1に示します。発現プラスミドをS. cerevisiae株WB-12（MATα ade2-1 trp1-1 ura3-1 can1-100 aac1::LEU2 aac2::HIS3）に形質転換しました。 33、aac1 および aac2 遺伝子が破壊され、LiAc/SS キャリア DNA/ ＰＥＧ法５５． 成功した形質転換体を、２％（ｗ／ｖ）グルコースを補充した合成完全トリプトファンドロップアウト培地（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ）プレート上で選択した。 ベクターのマルチクローニングサイトを復元することによって生成された空のベクターをコントロールとして使用しました。

野生型または変異タンパク質または空のベクターを発現するWB-12株を、2%(w/v)グルコースを補充した合成完全トリプトファンドロップアウト培地中で一晩増殖させた。 細胞を超純滅菌水で 3 回洗浄し、グルコースを完全に除去し、OD600 が 1 になるまで希釈しました。4 段階希釈 (1:10) を作成し、開始培養液 3.5 μL と各希釈液を分注しました。 YPG プレートに移し、30 °C で 72 時間インキュベートしました。 2 番目と 3 番目の希釈液のみを分析に使用しました。 各プレートには野生型と空のベクターコントロールが含まれていました。 野生型およびアラニン置換変異体の増殖は、濃度測定によって定量化されました。 プレートのスキャン画像または写真を、Fiji ソフトウェア (バージョン 2.3.0/1.53q)56、特に「ゲル分析」ツールを使用して分析しました。 コロニー (表面全体) の密度を測定し、両方から空のベクターの密度を差し引いた後、同じプレートと希釈の野生型の密度のパーセンテージとして表しました。 2 番目と 3 番目の希釈 (10-2、10-3) から計算された増殖パーセンテージを平均し、この値が 1 つの生物学的反復を構成しました。 実験は独立して 4 回繰り返されました。

それぞれの野生型および変異体タンパク質について、発現株の 1 L の前培養を使用して、eZ を備えた Applikon オートクレーブ可能な 15 L バイオバンドル内の 0.1% (w/v) グルコースを加えた 10 L の YPG 培地に接種しました。コントロール。 どちらの株から精製されたキャリアの収量、安定性、または活性にも差が観察されなかったため、WB-12 または W303-1B 株のいずれかを野生型の遺伝的背景として使用しました。 変異体としては、変異タンパク質の機能状態に関わらず十分な発現が可能なW303-1B株を選択した。 DYNO-MILL (Willy A. Bachofen) を使用して細胞を溶解し、ミトコンドリアを単離し 57、液体窒素中で瞬間凍結し、使用するまで -70 °C で保存しました。

単離された酵母ミトコンドリア (総タンパク質約 350 mg) を、20 mM Tris-HCl pH 7.5、10% (v/v) グリセロール、150 mM NaCl、20 mM イミダゾール pH 7.5、完全 EDTA フリーの 1 つを含むバッファーに再懸濁して可溶化しました。プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット (Roche) および 1% (w/v) ドデシル-β-マルトシド (Glycon Biochemicals GmbH) を加え、4 °C で 1 時間穏やかに撹拌します。 粒子状物質を超遠心分離 (235,000 × g、45 分、4 °C) によって除去し、可溶性画分を事前に洗浄および平衡化した (20 mM トリス-HCl pH 7.5、150 mM NaCl) ニッケル セファロース ビーズ (GE Healthcare) とともにインキュベートしました。 4 °C で 2 時間、穏やかに撹拌します。 未結合のタンパク質を遠心分離 (200 × g、5 分、4 °C) によって除去し、結合画分を空のカラム (BioRad) に置き、40 カラム容量の緩衝液 A (20 mM HEPES-NaOH pH) で洗浄しました。 7.5、150 mM NaCl、20 mM イミダゾール pH 7.5、0.1% (w/v) ドデシル-β-マルトシド、0.1 mg/mL テトラオレオイル カルジオリピン)、続いて 25 カラム容量の緩衝液 B (20 mM HEPES-NaOH pH 7.5、 150 mM NaCl、0.1% (w/v) ドデシル-β-マルトシド、0.1 mg/mL テトラオレオイル カルジオリピン)。 次いで、カラム材料を５００μＬの緩衝液Ｂで再懸濁し、オンカラム消化のために５ｍＭのＣａＣｌ２および１０μｇのＦａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充し、穏やかに撹拌しながら１０℃で一晩行った。 変異体 N123A、G192A、I193A、R197A、および R246A では、タンパク質が経時的に不安定になるため、オンカラム消化ステップは 30 μg の Factor Xa プロテアーゼを使用して 2 時間に短縮されました。 第 Xa 因子処理後、空の Proteus Midi スピンカラム (Generon) を使用して、切断されたタンパク質をニッケル セファロース樹脂から分離しました (200 × g、5 分、4 °C)。 タンパク質濃度は、分光光度計 (NanoDrop Technologies) を使用して 280 nm、またはビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイ キット (Thermo Fisher Scientific) で測定しました。 新たに精製したタンパク質を CPM 熱安定性シフトアッセイに使用しました。

エフェクター（基質または阻害剤）の存在下および非存在下での野生型および変異体のタンパク質集団の安定性の評価は、温度ランプによって誘導される熱的アンフォールディングを介して実施されました32。 このアッセイでは、最初はアクセスできなかったシステイン残基が熱変性によって溶媒にさらされ、蛍光団 N-[4-(7-ジエチルアミノ-4-メチル-3-クマリニル)フェニル]-マレイミド (CPM)40 と反応します。 この反応により蛍光付加物の形成が引き起こされ、これは回転式定量的 PCR (qPCR) 装置 (Rotorgene Q、Qiagen) を使用してモニタリングされます。 各実験では、ジメチルスルホキシド中の 5 mg/mL CPM ストック溶液を精製バッファー B (20 mM HEPES-NaOH pH 7.5、150 mM NaCl、0.1% (w/v) ドデシル-β-マルトシド) で 0.1 mg/mL に希釈しました。 、０．１ｍｇ／ｍＬテトラオレオイルカルジオリピン）を使用し、暗所、室温で１０分間平衡化した。 3 マイクログラムの精製タンパク質を関連エフェクター (示されている場合) と混合し、最終容量 45 μL になるまで緩衝液 B で希釈し、これに 0.1 mg/mL の CPM 溶液 5 μL を加えました。 エフェクター ADP および ATP を最終濃度 0.1、0.5、1、5、および 10 mM で添加し、CATR を 20 μM、BKA を 20 μM に加えて、キャリアが状態間を順番に循環できるようにするために 5 μM ADP を添加しました。阻害剤を結合します21。 混合物を非常に短時間ボルテックスし、暗所で 4 °C で 10 分間インキュベートした後、qPCR 装置に置きました。 続いて、タンパク質集団を 25 ～ 90 °C の温度勾配でアッセイしました。これは、毎分約 4 °C の速度に相当します。 タンパク質 - 蛍光体付加物によって放出される蛍光の増加が、装置の HRM チャネルで測定されました (励起は 440 ～ 480 nm、発光は 505 ～ 515 nm)。 アンフォールディングプロファイルは Rotor-Gene Q ソフトウェア 2.3 で分析され、アンフォールディング曲線の変曲点を使用して、試験したさまざまな条件におけるタンパク質の見かけの融解温度 (Tm) が決定されました。 ΔTm値は、エフェクターの各濃度におけるTmからエフェクターの非存在下でのタンパク質のTmを引くことによって得た。

細胞質が開いた状態の TtAac のモデルは、PDB コード 1okc、4c9h、4c9q、および 4c9j の鎖 A の構造ベースのアライメントと、残基 140 ～ 156 がらせん状であるべきであるという制約を使用して、Modeller バージョン 9.2258 で生成されました。 TtAac のマトリックスオープン状態構造、PDB コード: 6gci。 DOPE スコアリングはモデルをチェックするために使用されました。 キメラの構造をエネルギー最小化することでクラッシュスコアが改善されました。 結合部位残基を検査した後、K30 は 4c9h の同等の残基と比較して位置がシフトしており、元の配座異性体に戻りました。 最後に、4c9h の構造を反映するために N 末端と C 末端が切り詰められました。 水にアクセス可能な表面は、HOLE59 によって決定されました。

すべての図の結果は、示された実験数の平均値 ± SD として示されています。 データの統計分析は、以下に説明するように、GraphPad Prism バージョン 9.2.0 (GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実行されました。 相補実験では、増殖の差異を両側 1 サンプル t 検定によって分析し、変異体の増殖率を野生型の平均増殖率と比較しました。 変異体特異的 Tm 値と野生型 Tm 値の間の差を一元配置分散分析で評価し、続いてダネット事後検定を行って多重比較を補正しました。 阻害剤 (CATR および BKA) の存在下での変異体特異的 Tm 値と野生型 Tm 値の間の差を、同じ方法で評価しました (一元配置 ANOVA、その後のダネット事後検定)。 タンパク質変異体上の基質（ADP または ATP）によって誘発される熱シフトに関して、グループ間の差異を、試験した各ヌクレオチド濃度の相互作用を伴う二元配置分散分析によって評価しました。 基質レベル内のタンパク質変異体間の単純な効果を、野生型タンパク質に対するダネット事後テストを使用して分析および補正しました（図4、5に視覚化）。 各タンパク質レベルの基質間の単純な効果を分析し、Sidak事後テストによって補正しました（補足図7では10 mMについて視覚化）。 差異は 1% レベルで有意であるとみなされました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

ソースデータはこのペーパーに付属しています。 この研究で生成されたすべての相補性および熱安定性シフト データは、アクセッション コード https://doi.org/10.17632/mrhnw45w5y.1 (https://data.mendeley.com/datasets/mrhnw45w5y/1) で Mendeley データベースに保管されています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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統計解析に関するアドバイスをいただいた Gonçalo C. Pereira 博士と、相補性研究で使用した空の pYES3/CT 誘導体ベクターを生成した Chancievan Thangaratnarajah 博士に感謝いたします。 この研究は、ERSK に対する Medical Research Council Grant MC_UU_00028/2 によって支援されました。

Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit、ケンブリッジ大学、ケンブリッジ バイオメディカル キャンパス、Keith Peters Building、Hills Road、Cambridge、CB2 0XY、UK

ヴァシリキ・マブリドゥ、マーティン・S・キング、ソティリア・タヴォラリ、ジョナサン・J・ルプレヒト、シェーン・M・パーマー、エドマンド・RS・クンジ

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VM、MSK、ST、ERSK が研究を設計し、SMP が大規模発酵を実行し、VM と MSK が分子生物学とミトコンドリアの調製を実行し、VM がタンパク質を精製して生物物理学的分析を実行し、VM と ERSK がデータを分析しました。 JJR と ERSK が図を作成し、VM、MSK、ST、JJR と ERSK が論文を執筆

Edmund RS Kunji への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

マブリドゥ、V.、キング、MS、タヴォラリ、S. 他ミトコンドリアの ADP/ATP キャリアにおける基質の結合は、輸送サイクルの構造変化を導く段階的なプロセスです。 Nat Commun 13、3585 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-31366-5

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受信日: 2021 年 12 月 20 日

受理日: 2022 年 6 月 14 日

公開日: 2022 年 6 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31366-5

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