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Aug 06, 2023

深層学習を使用したルシフェラーゼの新規設計

Natura Volume 614, pagine

Nature volume 614、pages 774–780 (2023)この記事を引用

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495 オルトメトリック

メトリクスの詳細

De novo 酵素の設計では、目的の反応を触媒すると予測される活性部位と基質結合ポケットを、幾何学的に適合するネイティブの足場に導入することが試みられてきました 1,2 が、適切なタンパク質構造の欠如とネイティブのタンパク質配列の複雑さによって制限されてきました。 –構造関係。 今回我々は、多様なポケット形状とそれをコードする設計配列を含む理想的なタンパク質構造を多数生成する、深層学習ベースの「家族規模の幻覚」アプローチについて説明する。 私たちはこれらの足場を使用して、合成ルシフェリン基質であるジフェニルテラジン 3 および 2-デオキシセレンテラジンの酸化化学発光を選択的に触媒する人工ルシフェラーゼを設計します。 設計された活性部位は、高い形状相補性を持つ結合ポケット内の反応中に発生するアニオンに隣接してアルギニン グアニジニウム グループを配置します。 どちらのルシフェリン基質についても、高い選択性で設計されたルシフェラーゼが得られます。 これらの中で最も活性が高いのは、小型 (13.9 kDa) で熱安定性 (融解温度が 95 °C 以上) の酵素で、ジフェニルテラジンに対して触媒効率 (kcat/Km = 106 M−1 s−1) を持ちます。天然のルシフェラーゼですが、基質特異性ははるかに高いです。 生物医学における広範な応用を目的とした、高活性かつ特異的な生体触媒をゼロから作成することは、コンピューターによる酵素設計の重要なマイルストーンであり、私たちのアプローチにより、広範囲のルシフェラーゼやその他の酵素の生成が可能になるはずです。

ルシフェラーゼによるルシフェリン基質の酵素酸化によって生成される生物発光は、生物医学研究におけるバイオアッセイやイメージングに広く使用されています。 励起光源が必要ないため、暗闇の中で発光光子が生成されます。 これにより、生きた動物モデルや自家蛍光や光毒性が懸念される生体サンプルにおける蛍光イメージングよりも感度が高くなります4,5。 しかし、分子プローブとしてのルシフェラーゼの開発は、多くの理由により、十分に開発された蛍光タンパク質ツールキットの開発に比べて遅れています。 (ii) 同定されているものの多くは、構造を安定化させるために複数のジスルフィド結合を必要とするため、哺乳動物細胞でミスフォールディングが起こりやすい8。 (iii) ほとんどの天然ルシフェラーゼは、より望ましい光物理学的特性を持つ合成ルシフェリンを認識しません 9。 (iv) 相互に直交するルシフェラーゼとルシフェリンのペアを使用して複数のプロセスを並行して追跡する多重イメージングは​​、天然ルシフェラーゼの基質特異性が低いため制限されてきました 10,11。

私たちは、de novo タンパク質設計を使用して、小さく、安定性が高く、細胞内でよく発現し、1 つの基質に特異的で、機能するのに補因子を必要としないルシフェラーゼを作成することを目指しました。 高い量子収率、赤方偏移発光 3、良好な in vivo 薬物動態 12、13、および発光に必要な補因子の欠如のため、合成ルシフェリンであるジフェニルテラジン (DTZ) を標的基質として選択しました。 これまでの計算酵素設計の取り組みでは、主にタンパク質データバンク (PDB) にあるネイティブタンパク質の足場を再利用していました 1,2 が、DTZ に適した結合ポケットを備えたネイティブ構造はほとんどなく、ネイティブタンパク質に対する配列変更の影響は予測できない可能性があります (設計されたらせん束も酵素の足場として使用されています 14、15、16 が、これらの数は限られており、ほとんどは DTZ 結合に適したポケットを持っていません)。 これらの制限を回避するために、我々は、DTZ に適切なサイズと形状のポケットを備え、その後の活性部位の組み込みを容易にする明確な配列と構造の関係を備えた、小さくて安定したタンパク質足場を多数生成することに着手しました。 このようなポケットを収容できるタンパク質の折り畳みを特定するために、我々はまず DTZ を 4,000 個の天然の小分子結合タンパク質にドッキングしました。 多くの核輸送因子2（NTF2）様の折り畳みには、DTZの配置に適切な形状の相補性とサイズを備えた結合ポケットがあることがわかりました（図1eのピンクの破線）。したがって、NTF2様スーパーファミリーを標的トポロジーとして選択しました。

a、家族全体の幻覚。 目的のトポロジーを持つタンパク質をコードする配列は、多成分損失関数を使用したマルコフ連鎖モンテカルロ (MCMC) サンプリングによって最適化されます。 構造的に保存された領域 (ピーチ) は、NTF2 様タンパク質の 85 個の実験構造から得られた入力残基間の距離および配向分布との一貫性に基づいて評価されますが、可変の非理想的領域 (ティール) は信頼度に基づいて評価されます。ネットワーク予測とバックグラウンド分布の間の KL 発散として計算された、予測された残基間ジオメトリの数。 配列空間 MCMC サンプリングには、配列の変更と挿入および欠失 (補足方法を参照) の両方が組み込まれており、幻覚配列を目的の折り畳み構造をコード化する方向に誘導します。 水素結合ネットワークが設計された構造に組み込まれ、構造の特異性が向上します。 b–d、ルシフェラーゼ活性部位の設計。 b. ルシフェラーゼ基質 (DTZ) 配座異性体の生成。 c, アニオン性 DTZ を安定化し、疎水性パッキング相互作用を形成するための回転異性体相互作用場 (RIF) の生成。 d、幻覚足場へのRIFのドッキング、および位置特異的スコア行列（PSSM）バイアス配列設計を使用した基板と足場の相互作用の最適化。 e. NTF2 トポロジーの選択。 RIFは、5つを超えるループ残基を使用してルシフェリン基質に結合するタンパク質を除く、4,000の天然の小分子結合タンパク質にドッキングされた。 上位ヒットのほとんどは、NTF2 様タンパク質スーパーファミリー (ピンクの点線) によるものでした。 家族全体の幻覚足場生成プロトコルを使用して、1,615 個の足場を生成し、これらの足場が天然タンパク質よりも優れた予測 RIF 結合エネルギーを生み出すことを発見しました。 f、g、DL に最適化されたスキャフォールドは、ネイティブ構造の空間内でより多くのサンプルをサンプリングし (f)、ネイティブまたは以前の非深層学習エネルギーよりも強力な配列と構造の関係 (より信頼性の高い Alphafold2 構造予測) (g) を持ちます。 -最適化された足場。

ネイティブ NTF2 構造にはさまざまなサイズと形状のポケットがありますが、安定性を損なう長いループなど、理想的ではない機能も含まれています。 理想的な NTF2 様構造を多数作成するために、我々は、制約のない de novo 設計 17,18 とロゼッタ配列設計アプローチ 19 を統合した深層学習ベースの「家族規模の幻覚」アプローチを開発し、本質的に無制限の数の NTF2 様構造の生成を可能にしました。所望の折り畳みを有するタンパク質(図1a)。 家族全体の幻覚アプローチでは、ループ領域と可変領域については制約のないタンパク質幻覚の de novo 配列および構造発見機能 17,18 、およびコア領域については構造に基づく配列最適化を使用しました。 我々は trRosetta 構造予測ニューラル ネットワーク 20 を使用しました。これは、実験的に成功した新規設計タンパク質の同定や、多様なトポロジーの新しい球状タンパク質の幻覚に効果的です。 2,000 個の天然に存在する NTF2 の配列から開始して、配列空間でモンテカルロ検索を実行し、各ステップで配列を変更し、trRosetta を使用して構造を予測しました。 損失関数ガイド検索として、コア残基ペア幾何学上のトポロジー固有の損失関数で補足された、予測された構造におけるニューラル ネットワークの信頼性 (以前の無料幻覚研究と同様) を使用しました (補足方法を参照)。 ループ領域では、残基の数を変化させることもでき、その結果、理想に近い短いループが得られました。 構造特異性をさらにコード化するために、埋め込まれた長距離水素結合ネットワークを組み込みました。 得られた1,615の家族全体の幻覚NTF2足場は、天然の小分子結合タンパク質よりもDTZに対してより形状相補的な結合ポケットを提供しました（図1e）。 この方法では、天然の NTF2 様タンパク質に近く (図 1f)、以前の非深層学習エネルギーベースのアプローチで生成されたものよりも優れた足場品質メトリクスを持つタンパク質骨格がサンプリングされます 21 (図 1g)。

計算による酵素設計は一般に、反応遷移状態を囲むタンパク質官能基からなる理想的な活性部位またはテオザイムから始まり、それが既存の足場セットに適合されます 1,2。 しかし、（この研究の時点では）ルシフェリン基質を伴うアポ構造はほんの一握りしか解明されておらず、ホロ構造は解明されていないため、天然の海洋ルシフェラーゼの詳細な触媒幾何学的形状はよく理解されていない22、23、24。 量子化学計算 25,26 と実験データ 27,28 の両方は、化学発光反応がアニオン種を介して進行し、周囲の極性がその後の三重項分子酸素による単一電子移動 (SET) プロセスの自由エネルギーを実質的に変える可能性があることを示唆しています ( 3O2）。 これらのデータ（拡張データ図 1）に基づいて、下流のジオキセタン発光体の熱分解ステップが自発的であると仮定して、DTZ のアニオン状態を安定化し、SET エネルギー障壁を下げる形状相補的な触媒サイトの設計を目指しました。 アニオン状態を安定させるために、我々は、イミダゾピラジノン基上で発生する負電荷を安定させるために、アルギニン残基の正電荷を帯びたグアニジニウム基を配置することに焦点を当てました。

このような活性部位を多数の幻覚NTF2足場に計算機的に設計するために、我々はまずアニオン性DTZ配座異性体のアンサンブルを生成した（図1b）。 次に、各配座異性体について、RifGen 法 29,30 を使用して、DTZ との水素結合および無極性相互作用を形成するアミノ酸側鎖の何百万もの配置からなる 3 次元グリッド上の回転異性体相互作用場 (RIF) を列挙しました (図 1c)。 。 アルギニン グアニジニウム グループは、負の電荷を安定化するためにイミダゾピラジノン グループの N1 原子に隣接して配置されました。 次に、RifDock を使用して各 DTZ 配座異性体と関連する RIF を各足場の中央空洞にドッキングし、タンパク質と DTZ の相互作用を最大化しました。 アニオン性イミダゾピラジノンコアを安定化するためのアルギニン残基を含む、平均8つの側鎖回転異性体が各ポケットに位置しました（補足図2a）。 最も有利な側鎖とDTZの相互作用を持つ上位50,000個のドックについては、RosettaDesign（図1d）を使用して配列の残りの部分を最適化し、折り畳み性を確保するために自然に観察される配列変動に偏りながらDTZへの高親和性結合を実現しました。 設計プロセス中、足場内の事前定義された水素結合ネットワーク (HBNet) は、構造の特異性と安定性のために無傷に保たれ、これらの HBNet 側鎖と DTZ との相互作用は、RifDock ステップで明示的に必要とされ、残基の事前組織化を確実にしました。触媒作用に必須です。 最初の配列設計ステップでは、すべての RIF および HBNet 残基のアイデンティティを固定したままにし、側鎖と DTZ の相互作用を適切な位置に保持し、構造特異性を維持するために周囲の残基を最適化しました。 2 番目の配列設計ステップでは、ロゼッタはビニング効果により RIF では見逃された無極性および芳香族パッキング相互作用を特定できるため、RIF 残基の同一性 (アルギニンを除く) も変更することができました。 配列設計中、足場骨格、側鎖、および DTZ 基質をデカルト空間でリラックスさせました。 配列の最適化後、リガンド結合エネルギー、タンパク質とリガンドの水素結合、形状の相補性、接触分子表面に基づいてデザインがフィルタリングされ、7,648 個のデザインが選択され、実験スクリーニング用のプールされたオリゴとして注文されました。

各設計の 2 つの半分をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てて全長遺伝子を作成し、大腸菌発現ベクターにクローニングしました (補足方法を参照)。 コロニーベースのスクリーニング法を使用して、ライブラリーから活性ルシフェラーゼコロニーを直接画像化し、選択したクローンの活性を96ウェルプレート発現を使用して確認しました（拡張データ図2）。 3 つのアクティブなデザインが特定されました。 私たちはこれらの中で最も活性の高いものを LuxSit (ラテン語の lux sit、「光を存在させる」に由来) と呼びます。これは、私たちの知る限り、117 残基 (13.9 kDa) で、これまでに記載されたどのルシフェラーゼよりも小さいです。 SDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィー（図2a、bおよび拡張データ図3）を含む生化学分析により、LuxSitは大腸菌で可溶性かつ単量体で高度に発現していることが示されました。 円二色性 (CD) 分光法では、強力な遠紫外 CD サインが示され、組織化された α-β 構造が示唆されました。 CD 融解実験により、タンパク質は 95 °C では完全には折りたたまれず、温度が下がると完全な構造が回復することが示されました (図 2c)。 LuxSit を DTZ とインキュベートすると、DTZ 化学発光スペクトルと一致する、約 480 nm の発光ピークを持つ発光が得られました (図 2d)。 LuxSit の結晶構造を決定することはできませんでしたが、AlphaFold2 (参考文献 31) によって予測された構造は、バックボーン レベル (二乗平均平方根偏差 (RMSD) = 1.35 Å) 以上の設計モデルに非常に近似しています。側鎖は基板と相互作用します（図2e）。 設計されたLuxSit活性部位にはTyr14-His98およびAsp18-Arg65ダイアドが含まれており、His98のイミダゾール窒素原子はTyr14およびDTZのO1原子と水素結合相互作用を形成します（図2f）。 Arg65のグアニジニウムカチオンの中心はDTZのN1原子から4.2Åにあり、Asp18はグアニジニウム基およびArg65の主鎖N-Hと二座水素結合を形成します（図2g）。

a、大腸菌から精製された組換えLuxSitのクーマシー染色SDS-PAGE（ゲルソースデータについては、補足図1を参照）。 b. 精製された LuxSit のサイズ排除クロマトグラフィーは、単分散およびモノマー特性を示唆しています。 c、25 °C (黒)、95 °C (赤)、および 25 °C (緑) に冷却したときの遠紫外 CD スペクトル。 220 nm での LuxSit の CD 融解曲線を挿入します。 MRE、モル残基楕円率。 d、LuxSitの存在下（青）および非存在下（緑）におけるDTZの発光スペクトル。 e. 設計モデル (青色) と AlphaFold2 予測モデル (灰色) の構造的整合。バックボーン (左) レベルと側鎖 (右) レベルの両方で緊密に一致しています。 f – i、基質相互作用残基の部位飽和突然変異誘発。 側鎖レベルで設計されたモデル (青) と AlphaFold2 (灰色) モデルの拡大図 (左)、Tyr14-His98 コア HBNet (f)、Asp18-Arg65 ダイアド (g)、π- の設計された酵素 - 基質相互作用を示しています。スタッキング (h) および疎水性パッキング (i) 残基。 配列プロファイル（右）は、さまざまな配列バリアントの活性：（指定されたアミノ酸の活性）/（指定された位置でのすべてのテストされたアミノ酸の活性の合計）によってスケールされます。 活性が増加した A96M および M110V 置換はピンク色で強調表示されます。

ソースデータ

次に、LuxSit の設計から得られた知識を応用して 2-デオキシセレンテラジン (h-CTZ) 特異的ルシフェラーゼを作成することを目指しました。 h-CTZ の分子形状は DTZ の分子形状とは異なるため、ポケット形状が一致し、モデルの信頼性が高い NTF2 スーパーファミリー足場の追加セットを作成しました (補足方法を参照) (AlphaFold2 予測局所距離差検定 (pLDDT) > 92）。 次に、これらの足場に触媒部位を設置し、DTZ の最初のラウンドで最も成功したヒスチジンとアルギニンの基質相互作用幾何学構造を使用して、最初のシェルタンパク質側鎖 - h-CTZ 相互作用を設計しました。 シーケンスの残りの部分を設計するために、RosettaDesign よりも優れた安定性、溶解性、精度を実現できる ProteinMPNN32 を使用しました。 AlphaFold2 で予測された pLDDT、Cα RMSD、接触分子表面、およびロゼッタで計算された結合エネルギーに基づいてフィルター処理した後 (補足方法を参照)、大腸菌で 46 のデザインを選択して実験的に発現させ、2 つ (HTZ3-D2 および HTZ3) を特定しました。 -G4)は、h-CTZルシフェリン基質に対してルシフェラーゼ活性を有しました。 どちらの設計も可溶性が高く、単分散かつ単量体であり、ルシフェラーゼ活性は LuxSit と同程度でした (拡張データ図 4)。 第 2 ラウンドでは、成功率が 3/7,648 配列から 2/46 配列に増加しました。これはおそらく、第 1 ラウンドでの活性部位幾何学に関する知識と、ProteinMPNN による配列設計法のロバスト性の向上によるものと考えられます。

私たちの設計の中で最も活性なLuxSitの触媒作用への寄与をより深く理解するために、基質結合ポケットの各残基を一度に1つずつ他のアミノ酸に変異させる部位飽和変異誘発（SSM）ライブラリーを構築しました。 （補足方法を参照）、ルシフェラーゼ活性に対する各変異の影響を決定しました。 図 2f–i は、主要な位置におけるアミノ酸の優先順位を示しています。 Arg65は高度に保存されており（図2g）、そのダイアドパートナーであるAsp18はGlu（活性を低下させる）にのみ変異することができるため、カルボキシレート-Arg65の水素結合がルシフェラーゼ活性にとって重要であることが示唆されています。 Tyr14-His98 ダイアド (図 2f) では、Tyr14 を Asp および Glu で置換でき、His98 を Asn で置換できます。 すべての活性変異体はこれらの位置に水素結合ドナーとアクセプターを持っているため、このダイアドは発光に必要な電子とプロトンの移動を仲介するのに役立つ可能性があります。 結合界面の疎水性（図2i）およびπスタッキング（図2h）残基は、他の芳香族または脂肪族置換を許容し、一般に元の設計のアミノ酸を優先します。これは、突然変異効果のモデルベースの親和性予測と一致しています（拡張データ）図5）。 A96M および M110V 変異体 (ピンク色で強調表示) は、LuxSit と比較して、それぞれ活性を 16 倍および 19 倍増加させます (補足表 1)。 これらの結果に基づいた最適化により、フラッシュタイプの発光速度を持つ LuxSit-f (A96M/M110V) と、LuxSit の 100 倍以上の光子束を持つ LuxSit-i (R60S/A96L/M110V) が得られました。拡張データ 図6)。 全体として、活性部位飽和変異誘発の結果は、Tyr14-His98 および Asp18-Arg65 ダイアドが触媒作用において重要な役割を果たしており、基質結合ポケットがほぼ保存されているという設計モデルを裏付けています。

最も活性な触媒、LuxSit-i (拡張データ図 3b、e、h) および LuxSit-f (拡張データ図 3c、f、i) は両方とも大腸菌内で高レベルで可溶的に発現され、単量体です (高タンパク質濃度ではいくらかの二量体化が観察されました;拡張データ図3l)および熱安定性(拡張データ図3j、k)。 CTZを使用するネイティブルシフェラーゼと同様に、LuxSit-iとLuxSit-fの両方の見かけのミカエリス定数（Km）は低マイクロモル範囲にあり（図3a）、発光シグナルは速い触媒代謝回転により時間の経過とともに減衰します（拡張）データ図 7a)。 LuxSit-i は非常に効率的な酵素であり、触媒効率 (kcat/Km) は 106 M-1 s-1 です。 発光シグナルは肉眼で容易に見ることができ（図3b）、光子束（1秒あたりの光子数）は天然のRenilla reniformisルシフェラーゼ（RLuc）よりも38％大きい（補足表2）。 LuxSit-i によって触媒される DTZ 発光反応は pH 依存性であり (拡張データ図 7b)、提案されたメカニズムと一致しています。 私たちは、密度汎関数理論 (DFT) 計算と分子動力学 (MD) シミュレーションを組み合わせて、LuxSit アクティビティの基礎をより詳細に調査しました。 この結果は、アニオン安定化メカニズムを裏付けており（拡張データ図8aおよび補足図3a）、LuxSit-iがLuxSitよりも優れたDTZ遷移状態電荷安定化を提供することを示唆しています（拡張データ図8b）。

a、LuxSit、LuxSit-f、およびLuxSit-i活性の基質濃度依存性。 数字は、Vmax (光子 s-1 分子-1) でのシグナル対バックグラウンド (S/N) 比を示します。 データは平均値 ± 標準偏差 (n = 3) です。 b. BioRad Imager (上) または Apple iPhone 8 カメラ (下) によって取得された発光画像。 チューブは左から右へ: DTZ のみ。 DTZ プラス 100 nM 精製 LuxSit; DTZ と 100 nM の精製 LuxSit-i を組み合わせたもので、光子生成の高い効率が示されています。 c、LuxSit-i-mTagBFP2を一時的に発現する生きたHEK293T細胞の蛍光および発光顕微鏡画像。 LuxSit-i アクティビティは単一細胞解像度で検出できます。 左、mTagBFP2 シグナルを表す蛍光チャネル。 右、25 μM DTZ を添加した直後、励起光なしで 10 秒間の露光中に全発光光子が収集されました。 挿入図、ネガティブコントロール、DTZによるトランスフェクトされていない細胞。 スケールバー、20μm。 倍率40倍。

ソースデータ

ルシフェラーゼは細胞生物学研究で一般的に使用される遺伝子タグおよびレポーターであるため、生きた哺乳類細胞における LuxSit-i の発現と機能を評価しました。 LuxSit-i-mTagBFP2を発現するHEK293T細胞はDTZ特異的発光を示し（図3c）、これはLuxSit-i-mTagBFP2の核、膜およびミトコンドリアへの標的化後も維持されました（拡張データ図9）。 天然ルシフェラーゼおよび以前に操作されたルシフェラーゼは非常に無差別であり、多くのルシフェリン基質に対して活性があります（図4acおよび補足図4）。 これはおそらく、それらの大きくて開いたポケットの結果である（1つのルシフェリン基質に対して高い特異性を持つルシフェラーゼは、広範な指向性進化を行ったとしても制御することが困難であった33,34）。 対照的に、LuxSit-i は、標的ルシフェリンに対して優れた特異性を示し、ビス CTZ よりも 50 倍の DTZ 選択性を示しました (これは 1 つのベンジル炭素のみが異なります。MD シミュレーションでは、これはより大きな遷移状態形状の相補性から生じることが示唆されています (拡張データ)図8b、cおよび補足図3b、c））、8pyDTZと比較して28倍の選択性（窒素原子が1つだけ異なる）、および他のルシフェリン基質と比較して100倍を超える選択性（図4b）。 h-CTZ のアクティブな設計の 1 つ (HTZ3-G4) も、その標的基質に対して高度に特異的でした (図 4c および拡張データ図 4d)。 全体として、私たちが設計したルシフェラーゼの特異性は、天然のルシフェラーゼ 35、36 または以前に操作されたルシフェラーゼ 37 の特異性よりもはるかに優れています (補足表 5)。

a、セレンテラジン基質類似体の化学構造。 b、選択されたルシフェリン基質に対するLuxSit-iの正規化された活性。 100 nM LuxSit-i の存在下での示された基質の発光画像 (上) およびシグナル定量化 (下)。 LuxSit-i は設計対象基板 DTZ に対して高い特異性を持っています。 c、LuxSit-iの基質特異性のヒートマップ視覚化。 ウミシイタケルシフェラーゼ (RLuc); ガウシアルシフェラーゼ (GLuc); Oplophorus ルシフェラーゼから改変された NLuc。 そして h-CTZ 用に設計された de novo ルシフェラーゼ (HTZ3-G4) です。 ヒート マップは、各基質上の各酵素の発光を示します。 値は、酵素ごとに、すべての基質にわたるその酵素の最高シグナルに正規化されます。 d. LuxSit-i-DTZ (緑) および RLuc-PP-CTZ (紫) の発光スペクトルは、528/20 および 390/35 フィルター (破線のバーで表示) によってスペクトル的に分解でき、同族の基質のみを認識します。 e、マルチプレックスルシフェラーゼアッセイの概略図。 CRE-RLuc、NF-κB-LuxSit-i、CMV-CyOFP プラスミドを一過性にトランスフェクトした HEK293T 細胞をフォルスコリン (FSK) またはヒト腫瘍壊死因子 (TNF) で処理して、標識ルシフェラーゼの発現を誘導しました。 f、g、細胞からの発光シグナルは、プレートリーダーによる基質分解法またはスペクトル分解法のいずれかで測定できます。 f、基質分解法の場合、PP-CTZまたはDTZのいずれかを添加した後、フィルターなしで発光強度を記録しました。 g. スペクトル分解法では、PP-CTZ と DTZ の両方が追加され、528/20 フィルターと 390/35 フィルターを同時に使用して信号が取得されました。 f および g では、下のパネルは FSK または TNF の添加を示します。 CelLytic M 試薬中の 15,000 個の細胞の溶解物から発光シグナルを取得し、CyOFP 蛍光シグナルを使用して細胞数とトランスフェクション効率を正規化しました。 すべてのデータは、対応する非刺激対照に対して正規化されました。 データは平均値 ± 標準偏差 (n = 3) です。

ソースデータ

我々は、LuxSit-iの高い基質特異性により、基質特異的またはスペクトル分解された発光シグナルを通じて発光レポーターの多重化が可能になると推論しました（図4dおよび拡張データ図10a、b）。 この可能性を調べるために、LuxSit-iをNF-κB応答要素の下流に、RLucをcAMP応答要素の下流に配置しました（図4e）。 NF-κB シグナル伝達経路の活性化因子 (TNF) を添加すると、細胞を DTZ とインキュベートすると発光が生じますが、PP-CTZ (RLuc の基質) の発光は cAMP-PKA 経路が活性化された場合にのみ観察されました (図.4f）。 DTZ と PP-CTZ は異なる波長で発光するため、原理的には組み合わせることができ、スペクトル分析を通じて 2 つの信号をデコンボリューションすることができます。 実際、NF-κB シグナル伝達を活性化すると DTZ 波長で発光が生じ、cAMP-PKA 経路活性化因子 (FSK) を添加すると PP-CTZ 波長で発光が生じることが観察され、2 つのシグナル伝達の活性化を同時に評価できるようになりました。両方の基質を一緒に提供することにより、細胞溶解物（図4g）または無傷のHEK293T細胞（拡張データ図10c〜e）のいずれかを使用して、同じサンプル内のシグナル伝達経路を解析します。 したがって、LuxSit-i の高い基質特異性により、多様な細胞応答の多重レポートが可能になります。

計算による酵素の設計は、利用可能な足場の数によって制約されており、触媒の構成や酵素と基質の形状の相補性を達成できる範囲が制限されています 14、15、16。 ここで深層学習を使用して大量の新たに設計された足場を生成すると、この制限がなくなり、より正確な RoseTTAfold (参考文献 38) と AlphaFold2 (参考文献 31) により、ファミリーを通じてタンパク質足場をさらに効率的に生成できるようになります。 -広範な幻覚およびその他のアプローチ18,39。 足場ポケットの形状とサイズの多様性により、さまざまな触媒幾何学形状を考慮し、反応中間体と酵素の形状の相補性を最大化することができました。 私たちの知る限り、LuxSit に似たフォールドを持つ天然ルシフェラーゼは存在せず、この酵素は自然界には存在しない完全合成ルシフェリン基質に対して高い特異性を持っています。 LuxSit-i は、遷移状態を安定させるためのより相補的なポケットを提供する 3 つの置換を組み込むことにより、これまでに新たに設計された酵素よりも高い活性を持ち、kcat/Km (106 M-1 s-1) を示します。さまざまなネイティブルシフェラーゼ。 設計されたレトロアルドラーゼについてこの範囲の触媒効率を得るには数十ラウンドの定向進化が必要であり、構造は大幅に改造されたため、これはコンピューターによる酵素設計の注目すべき進歩である40。 対照的に、LuxSit と LuxSit-i の間のリガンドと側鎖の相互作用の予測される違いは非常に微妙です（補足図 2b。このような高い活性をコンピューターから直接達成することは、コンピューターによる酵素設計における課題のままです）。 LuxSit-i はサイズが小さく、安定性があり、堅牢なフォールディングを行うため、目的のタンパク質へのルシフェラーゼ融合や、容量が制限されたウイルス ベクターの遺伝タグとして適しています。 基礎科学の面では、LuxSit-i はサイズが小さく、単純で、活性が高いため、ルシフェラーゼ触媒機構の計算および実験研究に優れたモデル システムになります。 ここで使用したアプローチを拡張して、DTZ および h-CTZ を超えて合成ルシフェリン基質に対して同様に特異的なルシフェラーゼを作成することは、図 4 に示す多重化の機会を大幅に拡張し (特に最近の顕微鏡法の進歩 41)、新世代の多重化発光ツールキットを可能にするでしょう。 。 より一般的には、私たちの家族全体の幻覚法は、基質結合と触媒残基の配置のためのほぼ無制限の数の足場の可能性を開きます。これは、反応メカニズムとそれを促進する方法が完全に理解されていない場合に特に重要です：多くの代替構造仮説と触媒仮説形状と化学的に相補的な結合ポケットを簡単に列挙できますが、触媒残基の配置は異なります。 ルシフェラーゼは発光を触媒する点で独特ですが、基質から生成物への化学変換はすべての酵素に共通であり、ここで開発されたアプローチはさまざまな化学反応に容易に適用できるはずです。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

図のソースデータ。 2 ～ 4 はオンラインで入手できます。 LuxSit-i の遺伝子配列は、受託番号 OP820699 で GenBank に寄託されています。 LuxSit および LuxSit-i の設計モデルについては、補足データを参照してください。 細菌および哺乳動物の発現用に LuxSit-i をコードするコドン最適化プラスミドは、Addgene から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

Rosetta 高分子モデリング スイート (https://www.rosettacommons.org) は、学術ユーザーおよび非営利ユーザーが無料で利用できます。 このスイートの商用ライセンスは、ワシントン大学技術移転オフィスを通じて入手できます。 RIF ドッキング実装のソース コードは、https://github.com/rifdock/rifdock から無料で入手できます。 すべての関連スクリプトと、家族全体の幻覚足場生成に付随する Jupiter ノートブックは、ここから入手できます: https://files.ipd.uw.edu/pub/luxSit/scaffold_generation.tar.gz。 生成されたすべてのスキャフォールドは、https://files.ipd.uw.edu/pub/luxSit/scaffolds.tar.gz から入手できます。 ルシフェラーゼ ライブラリの計算設計スクリプトは、https://files.ipd.uw.edu/pub/luxSit/luciferase_designs_methods.zip から入手できます。

ジャン、L.ら。 レトロアルドール酵素の新たな計算設計。 サイエンス 319、1387–1391 (2008)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rothlisberger, D. et al. 計算酵素設計によるケンプ除去触媒。 Nature 453、190–195 (2008)。

論文 ADS PubMed Google Scholar

そうだ、HWら。 生物発光イメージングを強化するためのレッドシフトしたルシフェラーゼとルシフェリンのペア。 ナット。 方法 14、971–974 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ラブ、AC & プレッシャー、JA 光を見る (そして使う) : 生物発光技術の最近の発展。 細胞化学。 バイオル。 27、904–920 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Syed, AJ & Anderson, JC バイオテクノロジーおよびそれ以降における生物発光の応用。 化学。 社会改訂 50、5668–5705 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ええ、H.-W. & Ai、H.-W. 生物発光および化学発光レポーターとバイオセンサーの開発と応用。 アンヌ。 アナル牧師。 化学。 12、129–150 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Zambito, G.、Chawda, C. & Mezzanotte, L. 生物発光イメージングのための新しいツール。 カー。 意見。 化学。 バイオル。 63、86–94 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Markova, SV、Larionova, MD & Vysotski, ES 海洋カイアシ類の分泌ルシフェラーゼに光を当てる: 最新の知識と応用。 フォトケム。 フォトビオール。 95、705–721 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jiang、TY、Du、LP、Li、MY セレンテラジンによる生物発光の解明：戦略と応用。 フォトケム。 フォトビオール。 科学。 15、466–480 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ミケリーニ、E. et al. 多重生物発光およびハイコンテントスクリーニングのためのスペクトル分解遺伝子技術。 アナル。 化学。 80、260–267 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ラスバン、ＣＭら。 直交生物発光ツールを迅速に同定するための並行スクリーニング。 ACS セント科学。 3、1254–1261 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yeh, H.-W.、Wu, T.、Chen, M.、Ai, H.-W. 生物発光イメージングを複雑にする要因の特定。 生化学 58、1689–1697 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

スー、YCら。 新しい NanoLuc 基質により、動物における明るい 2 集団生物発光イメージングが可能になります。 ナット。 方法 17、852–860 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lombardi, A.、Pirro, F.、Maglio, O.、Chino, M. & DeGrado, WF 4 螺旋バンドル金属タンパク質の新規設計: 1 つの足場、多様な反応性。 準拠化学。 解像度 52、1148–1159 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chino, M. et al. 新たに設計された4ヘリックスバンドル構造を持つ人工二鉄酵素。 ユーロ。 Ｊ．Ｉｎｏｒｇ． 化学。 2015、3352–3352 (2015)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Basler, S. et al. 新しいタンパク質足場における非生物学的反応の効率的なルイス酸触媒作用。 ナット。 化学。 13、231–235 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アニシュチェンコ、I. 他ディープネットワーク幻覚によるデノボタンパク質設計。 Nature 600、547–552 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang、J.ら。 深層学習を使用したタンパク質機能部位の足場構築。 サイエンス 377、387–394 (2022)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ノーン、C.ら。 立体構造最適化によるタンパク質配列設計。 手順国立アカデミー。 科学。 アメリカ合衆国。 118、e2017228118 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヤン、JYら。 予測された残基間の配向を使用したタンパク質構造予測の向上。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 117、1496–1503 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バサンタ、B.ら。 多様なポケット構造を持つタンパク質を新規設計するための列挙型アルゴリズム。 手順国立アカデミー。 科学。 米国 117、22135–22145 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Loening, AM、Fenn, TD & Gambhir, SS ルシフェラーゼとウミシイタケの緑色蛍光タンパク質の結晶構造。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 374、1017–1028 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

苫米地裕也ほか nanoKAZ の結晶構造: セレンテラジンとの生物発光反応を触媒する Oplophorus ルシフェラーゼの変異した 19 kDa 成分。 生化学。 生物物理学。 解像度共通。 470、88–93 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウー、N.ら。 5 つのジスルフィド結合を持つガウシアルシフェラーゼの溶液構造と、異核 NMR による推定セレンテラジン結合キャビティの同定。 科学。 議員 10、20069 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ding, BW & Liu, YJ 単一電子移動酸素化および電荷移動誘起発光のメカニズムを介したホタルイカの生物発光。 混雑する。 化学。 社会 139、1106–1119 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

イミダゾピラジノン誘導体の電荷移動誘起発光におけるスピン軌道結合の制御機構。 混雑する。 化学。 社会 130、132–149 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

近藤博 ほか 6-アリールイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン（ウミホタルルシフェリン類似体）の化学発光反応速度論に対する置換基の効果：三重項分子酸素による一電子移動（SET）酸素化機構の支持。 四面体Lett. 46、7701–7704 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

BR ブランキーニら。 ホタル生物発光における単一電子移動酸化機構の実験的裏付け。 混雑する。 化学。 社会 137、7592–7595 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Dou、JY 他蛍光活性化βバレルの新規設計。 自然 561、485–491。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cao、L.ら。 標的構造のみからタンパク質結合タンパク質を設計します。 ネイチャー 605、551–560 (2022)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ジャンパー、J. et al. AlphaFold による高精度なタンパク質構造予測。 Nature 596, 583–589 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dauparas、J. et al. ProteinMPNN を使用した堅牢な深層学習ベースのタンパク質配列設計。 サイエンス 378、49–56 (2022)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ええ、H.-W. 他。 in vivo イメージングを向上させる ATP 非依存性生物発光レポーターのバリアント。 ACS Chem. バイオル。 14、959–965 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiong、Y.ら。 操作された琥珀色発光ナノルシフェラーゼとその in vivo 免疫生物発光イメージングへの使用。 混雑する。 化学。 社会 144、14101–14111 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bhaumik, S. & Gambhir, SS 生きたマウスにおけるウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の光学イメージング。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 99、377–382 (2002)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Szent-Gyorgyi, C.、Ballou, BT、Dagnal, E. & Bryan, B. 新しい生物発光タンパク質のクローニングと特性評価。 Proc. SPIE 3600、Biomedical Imaging: Reporters, Dyes, and Instrumentation (Bornhop, DJ, Contag, CH & Sevick-Muraca, EM) https://doi.org/10.1117/12.351015 (SPIE、1999)。

ホール議員ら。 新規イミダゾピラジノン基質を利用した深海エビ由来の操作されたルシフェラーゼレポーター。 ACS Chem. バイオル。 7、1848–1857 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baek、M.ら。 3 トラック ニューラル ネットワークを使用したタンパク質の構造と相互作用の正確な予測。 サイエンス 373、871-+ (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィッキー、BIM 他対称的なタンパク質集合体の幻覚。 サイエンス 378、56–61 (2022)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ギーガー、L.ら。 設計されたレトロアルドラーゼの進化は、完全な活性部位リモデリングにつながります。 ナット。 化学。 バイオル。 9、494–498 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yao、Z.ら。 フェーザー解析による多重生物発光顕微鏡法。 ナット。 方法 19、893–898 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

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CD 測定にご協力いただきました B. Wicky と R. Kibler に感謝いたします。 X. Li はタンパク質の質量分析を支援してくれました。 細胞イメージングの初期調査については D. Feldman。 L. Milles 氏、ゴールデン ゲート アセンブリ プロトコルの最適化について。 量子力学と MD シミュレーションで使用される計算リソースを提供した中国国家自然科学財団 (22103060)。 一部の図パネルは BioRender.com で部分的に作成されました (図 4e、拡張データ図 2 および 10c)。 この出版物で報告された研究は、賞番号 K99EB031913 の下で国立衛生研究所の国立生物医学画像生物工学研究所によって部分的に支援されました。 内容は著者のみの責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。 私たちは、ハワード ヒューズ医学研究所 (YK、BC、DB) からの資金提供を認めます。 ヘンリエッタ＆オーブリー・デイビス夫妻はワシントン大学生化学教室（DB）の寄附教授職に就いている。 NIH 独立への道賞 (AH-WY、K99EB031913)。 United World Antivirus Research Network (UWARN) (新興感染症研究センターの 1 つ、CREID) NIAID 1 U01 AI151698-01 (DB および AH-WY)。 Institute for Protein Design (DB および AH-WY) の Audacious プロジェクト。 オープン慈善プロジェクト改善タンパク質設計基金 (DB)。 ノボ ノルディスク財団 (CN、NNF18OC0030446)、ワシントン研究財団フェローシップ (SP)。 E. および W. シュミット、シュミット フューチャーズ プログラム (DT、GRL、JZZ、LC、SH、MD、LC および DB) の推薦による。 および国立科学財団 (KNH、DE および PM、CHE-1764328、および XSEDE に対する OCI-1053575)。

これらの著者は同様に貢献しました: Andy Hsien-Wei Yeh、Christoffer Norn

ワシントン大学生化学教室、シアトル、ワシントン州、米国

アンディ・シェンウェイ・イェー、クリストファー・ノーン、ヤコフ・キプニス、ダグ・ティッシャー、サミュエル・J・ペロック、ギュ・リー・リー、ジェイソン・Z・チャン、イワン・アニシチェンコ、ブライアン・コヴェントリー、ロンシン・カオ、ジャスタス・ダウパラス、デヴィッド・ベイカー

ワシントン大学タンパク質設計研究所、シアトル、ワシントン州、米国

アンディ・シェンウェイ・イェー、クリストファー・ノーン、ヤコフ・キプニス、ダグ・ティッシャー、サミュエル・J・ペロック、ギュ・リー・リー、ジェイソン・Z・チャン、イワン・アニシチェンコ、ブライアン・コヴェントリー、ロンシン・カオ、ジャスタス・ドーパラス、サメール・ハラビヤ、ミシェル・デウィット、ローレン・カーター、デヴィッド・ベイカー

米国カリフォルニア州サンタクルーズ、カリフォルニア大学サンタクルーズ校生体分子工学科

アンディ・シェンウェイ・イェー

ワシントン大学ハワード・ヒューズ医学研究所、シアトル、ワシントン州、米国

ヤコフ・キプニス、ブライアン・コヴェントリー、デヴィッド・ベイカー

カリフォルニア大学ロサンゼルス校化学生化学学部、ロサンゼルス、カリフォルニア州、米国

デクラン・エバンス、ペンチェン・マー、KN・ホーク

西安化学科 持続可能エネルギー材料化学重点研究室、MOE 非平衡合成および凝縮物質変調重点研究室、西安交通大学、中国西安

マー・ペンチェン

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DBが監修した作品です。 AH-WY はこのプロジェクトを発案し、実験的な特性評価を実施しました。 AH-WY、YK、および CN は初期設計戦略を概念化し調査し、AH-WY はルシフェラーゼのコンピューター設計を実行しました。 CN は、家族全体の幻覚パイプラインを概念化し、実装しました。 CN、DT、SJP、IA が足場の設計を行いました。 SJP は、NTF2 スキャフォールドの ProteinMPNN 配列設計を実行しました。 KNH は DE と PM に MD と量子力学の計算を指導し、原稿の機械論的な部分の執筆に貢献しました。 GRL は計算による SSM シミュレーションを開発しました。 JZZ は哺乳類細胞を調製し、顕微鏡イメージングを実施しました。 BCとLCはRifDockにチューニングファイル機能を統合しました。 JD がプロテイン MPNN を開発しました。 SH は、設計されたライブラリの組み立てを支援しました。 MD と LC はタンパク質の発現と精製を支援しました。 AH-WY、CN、DB が最初の原稿を書きました。 著者全員が結果について議論し、最終原稿に貢献しました。

Andy Hsien-Wei Yeh または David Baker への通信。

AH-WY、CN、YK、DT、SJP、IA、および DB は、以下を対象とするいくつかの仮特許出願 (ワシントン大学によって提出された出願番号 63/300171、63/300178、63/381922 および 63/381924) の共同発明者です。この記事で説明されている de novo ルシフェラーゼとタンパク質足場。 AH-WY、CN、JZ、DB は、この原稿で説明されている発明の開発を目的とする会社 Monod Bio の株主です。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

密度汎関数理論 (DFT) 計算により、アニオン状態の形成が三重項酸素 (3O2) の活性化に不可欠な電子源であることが示唆されました。 理論的証拠 25,26 と実験的証拠 27,28 の両方によって裏付けられているように、次の酸素化プロセスは、周囲の反応場がギブズ自由エネルギー (ΔGSET) の変化に大きな影響を与える可能性がある単一電子移動 (SET) メカニズムによるものと考えられます。 最後に、ジオキセタン発光体中間体の熱分解は、一般的に発エルゴンである徐々に可逆的な電荷移動誘起発光 (GRCTIL) の機構を介して光子を生成することができます。 すべての歴史的な証拠は仮想溶媒での計算または理想的な有機溶媒での化学発光に基づいているため、ルシフェラーゼ触媒による発光反応の詳細なメカニズムは不明のままです。 我々は、酵素の重要なステップはアニオン状態の形成を促進し、効率的なSETを促進する適切な環境を作り出すことであると提案した。 したがって、この研究の目標は、3O2 を効率的に活性化するために、アニオン性基質状態を安定化し、局所的なプロトン活性、溶媒極性、および疎水性を変更するために基質の周囲に酵素反応場を設計することです。

コンピュータで設計された DNA 配列をオリゴ アレイで購入し、そのフラグメントを PCR で増幅し、組み立てて、pBAD 細菌発現ベクターに連結しました。 プラスミド ライブラリーを使用して DH10B 細胞を形質転換しました。 LB 寒天プレート上で増殖した各コロニーは、1 つのルシフェラーゼ設計を表しました。 プレートに DTZ 溶液をスプレーし、ChemiDoc イメージャーを使用して画像化して活性コロニーを特定しました。 選択したコロニーを 96 ウェル プレートに接種し、発現させ、精製して個々のルシフェラーゼ活性を確認しました。 その後、プラスミドを個別に配列決定して、設計原理と酵素機能についての洞察を提供するアクティブな設計モデルを特定したり、さらなる進化のためにランダムな突然変異誘発にさらしたりすることができます。 挿入: このスクリーニングから 3 つのルシフェラーゼが同定されました。 最も活性が高く、DTZ に特異的なルシフェラーゼを「LuxSit」と呼びます。

a〜c、大腸菌におけるa、LuxSit、b、LuxSit-i、およびc、LuxSit-fの組換え発現。 各レーンの注釈は次のとおりです – 1: Pre-IPTG; 2: IPTG後。 3: 可溶性ライセート。 4: フロースルー。 5: 洗います。 6: 回避; 7: TEV 後の切断。 8: SEC 後。 d – f、精製された d のサイズ排除クロマトグラフィー、LuxSit。 e、LuxSit-i。 f、LuxSit-f モノマー。 g–i、g、LuxSit、h、LuxSit-i、および i、LuxSit-f のデコンボリューションされた質量スペクトル。 j、k、j、LuxSit-i の遠紫外円二色性 (CD) スペクトル (左パネル)。 k、25 °C (黒線)、95 °C (赤線)、25 °C (緑線) に冷却した LuxSit-f。 220 nm での CD 融解曲線 (右パネル)。 l、LuxSit-i を Tris pH 8.0 緩衝液中で高濃度 (約 50 μM) に濃縮した場合、二量体 SEC ピークが観察されました。 二量体および単量体の SEC 画分は両方とも SDS-PAGE で予想されたサイズを示し、両方のピークは 25 μM DTZ の存在下で触媒活性を示して発光しました。

a、大腸菌での組換え発現から精製されたHTZ3-D2およびHTZ3-G4のクーマシー染色SDS-PAGE。 b、HTZ3-D2 (左パネル) および HTZ3-G4 (右パネル) の拡大図は、ルシフェラーゼ-h-CTZ 相互作用の側鎖の事前組織化を示しています。 c、d、サイズ排除クロマトグラフィー（左）、デコンボリューションされた質量スペクトル（中央）、c、HTZ3-D2およびd、HTZ3-G4の選択された化合物に対する正規化されたルシフェラーゼ活性（右）。これは、設計の高い特異性を示唆しています。ターゲット基板、h-CTZ。 e、PBS中のLuxSit（w/DTZ）、HTZ3-D2（w/h-CTZ）、およびHTZ3-G4（w/h-CTZ）活性の基質濃度依存性。 すべてのデータ点はミカエリス・メンテン方程式に当てはめられました。 HTZ3-D2 と HTZ3-G4 は、LuxSit の Imax がそれぞれ約 25% と約 58% で、7.9 μM と 19.5 μM の Km 値を示しました。 データは平均値 ± 標準偏差 (n = 3) として表示されます。

各変異の計算された ddGbind を、相対平均実験ルシフェラーゼ活性の関数としてプロットしました。 仮説上の触媒残基の ddGbind : a、Tyr14-His98 および b、Asp18-Arg65 ダイアドは一般に最低ではなく、これらの設計された触媒残基が基質結合にとって好ましくないことを示唆しています。 赤い点は野生型 (LuxSit) アミノ酸を表します。 活性についてスクリーニングされた各位置の野生型 ddGbind のランクを c のヒート マップで示します。 d-f、d、e、π-πスタッキングまたはf、疎水性相互作用用に設計された残基の野生型ddGbindは、変異ddGbind値と比較して最も低かった。 これは、配列が基質結合にとって最適に近く、設計モデルが信頼できることを示しています。

考えられるすべての組み合わせを徹底的にスクリーニングするために、60、96、および 110 の位置で完全にランダム化されたライブラリを生成しました。 コロニーベースのスクリーニングの後、DTZ による強いルシフェラーゼ活性を持つ多くのコロニーを特定しました。 各コロニーを96ウェルプレートの各ウェルで個別に発現させ(1 mL培養物)、それに応じて精製しました(補足方法を参照)。 a. 選択した各変異体の個々の発光活性をプロットし、親の LuxSit と比較しました。 発光活性は、25μM DTZの存在下で測定されました。 発光活性 (RLU) は、最初の 15 分間にわたる統合シグナルとして示されました。 残基 b、60、c、96、および d、110 におけるアミノ酸頻度とルシフェラーゼ活性の統計分析。データは平均 ± sd として表示されます (変異体がランダム化されたライブラリーから選択されたため、n は各バーで異なります)。 Arg60 はループから生じており、水素結合パートナーを持たないため、構造的に明確に定義されていない可能性があるため、選択されたすべての変異体の中で Arg60 が変異可能であることが確認されています。 Ala96 はより大きな側鎖置換 (Leu、Ile、Met、および Cys) を好み、Met110 は疎水性残基 (Val、Ile、および Ala) を好みます。 LuxSit の 100 倍以上高い光子束を持つ新しく発見されたバリアント (R60S/A96L/M110V) には、その高輝度により LuxSit-i が割り当てられました。 配列アラインメントでは、突然変異が黄色のフォントと灰色の背景で強調表示されます。 Asp18–Arg65 および Tyr14–His98 の保存された触媒ダイアドは、緑と青のフォントで示されています。

a、50 μM DTZ の存在下で、LuxSit-i (赤)、100 nM 精製 LuxSit-i (緑)、または 100 nM 精製 LuxSit-f (青) を発現する 15,000 個の無傷の HeLa 細胞の正規化された発光動態。 HeLa 細胞におけるより拡張された発光動力学は、おそらく細胞膜を横切る DTZ の拡散速度によるものと考えられます。 b、さまざまなpH緩衝液におけるLuxSit-iの正規化された発光減衰曲線は、pH依存性の触媒機構を明らかにしました。 c、発光量子収率は、50 nMの対応するルシフェラーゼの存在下で125 pmolの基質が光子に完全に変換されるまで、統合された発光シグナルから推定されました（補足方法を参照）。 データは平均値として表示されます (n = 3)。

a, 密度汎関数理論 (DFT) によって計算された自由エネルギー プロファイルは、三重項酸素が反応体複合体 Int2 および TS1 を介して DTZ (Int1) のアニオン種と直接反応できることを示しています。 次に、ジオキセタン中間体 Int3 が開殻一重項遷移状態 OSSTS2 で開裂して励起中間体 Int4* を形成し、これにより CO2 が急速に押し出され、発光生成物 Int5 が形成されます。 注: Int4* または Int5* は観測された領域で発光しますが、Int4* の寿命は非常に短く、おそらく発光前に完全に Int5* に変換されます。 b、Int2とInt3をLuxSitとLuxSit-iの両方にドッキングし、結合を分子動力学(MD)によって評価しました。 基板の His98 から O1 (上の行) までの距離、および Arg65 から N1 までの距離 (下の行) を、500 ns MD シミュレーション全体にわたってプロットしました。 LuxSit-i (青色のトレース) は、LuxSit (赤色のトレース) よりもかなり良く Int2' (中央) に結合します。これは、LuxSit-i の変異が TS1 に対してより相補的な結合ポケットを提供することを示唆しています。 この結合配向により、基質の N1 が Arg65 に大幅に近づき、高エネルギー遷移状態の電荷安定化が向上します。 c、過酸化アニオン型のビス-CTZのLuxSit-iのポケットへのドッキング。 青色のオーバーレイは、元の設計モデルの DTZ を表します。 MD シミュレーション中、bis-CTZ のベンジル炭素 (緑色のトレース) が追加されると、LuxSit-i と遷移状態 (TS1 および TS2) の間の形状の相補性が破壊され、Arg65 による電荷の安定性が低下します。 この電荷の安定化は反応の進行に必要であり、bis-CTZ よりも DTZ に対する LuxSit-i の高い基質特異性を説明しています。

a、b、生きているa、HEK293T、およびb、LuxSit-i-mTagBFP2を発現するHeLa細胞の蛍光イメージング。これは標的化されていない、または核（Histone2B）、細胞膜（KRasCAAX）、またはミトコンドリア（DAKAP）細胞コンパートメントに局在しています。 スケールバー: 10 μm。 c、d、DPBS中の25μM DTZの存在下で、15,000個の無傷のc、HEK293Tまたはd、HeLa細胞を用いて発光シグナルを測定した。 トランスフェクション効率は、HEK293T 細胞では 60 ～ 70%、HeLa 細胞では 5 ～ 10% の範囲です。 e、LuxSit-iを発現するHEK293T細胞から取得した発光スペクトルは、大腸菌から精製した組換えLuxSit-iの発光スペクトルと一致しています。 f、g、発光シグナルは、DPBS中の25μMの示された基質の存在下で、15,000 f、無傷のLuxSit-i発現HEK293T細胞、またはg、細胞溶解物を用いて測定した。 発光強度はDTZシグナルに対して正規化されており、細胞ベースのアッセイにおいて他の基質よりも高いDTZ特異性を示しています。 データは、最初の 20 分間±標準偏差 (n = 3) にわたる総発光シグナルとして示されました。 h、主な図3cの発光画像の異なるセル（n = 10）を横断する線の正規化された発光強度プロファイル。 灰色の線はトランスフェクトされていない細胞を表します。 エラーバーは±SEMを表します。

a、LuxSit-i-DTZ と RLuc-PP-CTZ (Prolume Purple、メトキシ e-セレンテラジン) 発光ペア間の直交関係。 各ルシフェラーゼの示されたパーセンテージは、合計 100% になるように異なる比率で混合されました。 25 μM DTZ および PP-CTZ 基質の両方を添加した後、528/20 および 390/35 チャネルからのフィルター光を同時に測定しました。 b. ヒート マップは、同族または非同族 (DTZ または PP-CTZ またはその両方) 基質の存在下での個々のルシフェラーゼ (100 nM) または 1:1 混合物の発光シグナルを示します。 応答シグナルは、528/20 および 390/35 nm フィルターを備えた Neo2 プレート リーダーによって同時に取得されました。 c、CRE-RLuc、NFκB-LuxSit-i、およびCMV-CyOFPプラスミドの同時トランスフェクションおよびフォルスコリン（FSK）またはヒトTNFによる刺激後の、生HEK293Tにおけるマルチプレックスルシフェラーゼアッセイ。 d、e、15,000の無傷の細胞を、細胞を溶解せずにDPBSにDTZ、PP-CTZ、またはDTZとPP-CTZの両方を添加した後、d、基質分解モードまたはe、スペクトル分解モードのいずれかによってアッセイしました（補足方法を参照）。 CyOFP 蛍光シグナルの領域スキャンを使用して、細胞数とトランスフェクション効率を推定しました。 報告された単位は RLU/au でした。 Ex./Em.での相対光単位/蛍光強度測定。 = 480/580nm。 すべてのデータは、対応する非刺激対照に対して正規化されました。 データは平均値 ± 標準偏差 (n = 3) として表示されます。

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転載と許可

Yeh、A.HW.、Norn、C.、Kipnis、Y. 他深層学習を使用したルシフェラーゼの新規設計。 Nature 614、774–780 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-05696-3

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受信日: 2022 年 1 月 19 日

受理日: 2023 年 1 月 3 日

公開日: 2023 年 2 月 22 日

発行日: 2023 年 2 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05696-3

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自然化学 (2023)

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